核酸擴(kuò)增和檢測(cè)技術(shù)是當(dāng)今生物研究中最有價(jià)值的工具之一。生命科學(xué)各個(gè)領(lǐng)域（基礎(chǔ)研究、生物技術(shù)、醫(yī)學(xué)、法醫(yī)學(xué)、診斷學(xué)等）的科學(xué)家在廣泛的應(yīng)用中利用這些方法。對(duì)于某些應(yīng)用，定性核酸檢測(cè)就足夠了。然而，其他應(yīng)用則需要定量分析。實(shí)時(shí)熒光定量PCR可用于定性和定量分析；為您的應(yīng)用選擇最佳方法需要對(duì)該技術(shù)有廣泛的了解。上海通蔚蔚您介紹實(shí)時(shí) PCR、反轉(zhuǎn)錄定量 PCR 技術(shù)以及 Bio-Rad 為這些技術(shù)提供的儀器選擇。它還提供了 RNA 分離步驟的提示，例如樣品收集、RNA 提取以及分析 RNA 的質(zhì)量和數(shù)量。

  頁(yè)面內(nèi)容

  什么是實(shí)時(shí) PCR？

  實(shí)時(shí) PCR/qPCR 檢測(cè)的應(yīng)用

  實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 是如何工作的？

  RNA分離

  逆轉(zhuǎn)錄定量 PCR (RT-qPCR)

  qPCR/實(shí)時(shí) PCR 儀器

  什么是實(shí)時(shí) PCR？

  在傳統(tǒng) PCR 中，擴(kuò)增的 DNA 產(chǎn)物或擴(kuò)增子在終點(diǎn)分析中進(jìn)行檢測(cè)。在實(shí)時(shí) PCR 中，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，實(shí)時(shí)測(cè)量擴(kuò)增產(chǎn)物的積累，并在每個(gè)循環(huán)后進(jìn)行產(chǎn)物定量。

  下面的 qPCR 工作流程描述了實(shí)時(shí) PCR 的步驟。首先，使用 PCR 試劑和獨(dú)特或定制引物設(shè)置擴(kuò)增反應(yīng)。然后在實(shí)時(shí) PCR 儀器中運(yùn)行反應(yīng)，并通過(guò)專(zhuān)有儀器軟件分析收集的數(shù)據(jù)。

  PCR 產(chǎn)物的實(shí)時(shí)檢測(cè)是通過(guò)在每個(gè)反應(yīng)孔中包含熒光報(bào)告分子來(lái)實(shí)現(xiàn)的，隨著產(chǎn)物 DNA 量的增加，熒光報(bào)告分子會(huì)產(chǎn)生增強(qiáng)的熒光。用于此目的的熒光化學(xué)包括DNA結(jié)合染料和熒光標(biāo)記的序列特異性引物或探針。配備熒光檢測(cè)模塊的專(zhuān)用熱循環(huán)儀用于在擴(kuò)增發(fā)生時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)。測(cè)得的熒光與擴(kuò)增子總量成正比；熒光隨時(shí)間的變化用于計(jì)算每個(gè)循環(huán)中產(chǎn)生的擴(kuò)增子的量。

  與 PCR 相比，實(shí)時(shí) PCR 的主要優(yōu)點(diǎn)是，實(shí)時(shí) PCR 允許您在寬動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)準(zhǔn)確且高靈敏度地確定模板 DNA（擴(kuò)增目標(biāo)序列）的初始拷貝數(shù)。實(shí)時(shí) PCR 結(jié)果可以是定性的（序列是否存在）或定量的（拷貝數(shù)）。因此，定量實(shí)時(shí) PCR 也稱(chēng)為 qPCR 分析。相比之下，PCR 至多是半定量的。此外，無(wú)需凝膠電泳即可評(píng)估實(shí)時(shí) qPCR 數(shù)據(jù)，從而減少實(shí)驗(yàn)時(shí)間并提高通量。最后，由于在統(tǒng)一的閉管 qPCR 系統(tǒng)中運(yùn)行實(shí)時(shí) qPCR 反應(yīng)并評(píng)估數(shù)據(jù)，因此減少了污染的機(jī)會(huì)，并且在 qPCR 分析中消除了擴(kuò)增后操作的需要。

  實(shí)時(shí) PCR/qPCR 檢測(cè)的應(yīng)用

  實(shí)時(shí) PCR/qPCR 檢測(cè)已成為快速、靈敏地測(cè)定和定量各種生物樣品中核酸的首選工具，具有多種應(yīng)用，例如基因表達(dá)分析、食品中轉(zhuǎn)基因生物的檢測(cè)和癌癥表型分析。

  在研究實(shí)驗(yàn)室中，qPCR 檢測(cè)廣泛用于定量測(cè)量轉(zhuǎn)化細(xì)胞系中的基因拷貝數(shù)（基因劑量）或突變基因的存在。與逆轉(zhuǎn)錄 PCR (RT-PCR) 相結(jié)合，qPCR 檢測(cè)可通過(guò)測(cè)量細(xì)胞中的變化來(lái)精確定量基因表達(dá)的變化，例如，響應(yīng)不同環(huán)境條件或藥物治療的表達(dá)增加或減少。 mRNA 水平。

  實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 是如何工作的？

  為了了解實(shí)時(shí) PCR 的工作原理，我們使用典型的擴(kuò)增圖來(lái)說(shuō)明 qPCR 分析（圖 1）。在此圖中，x 軸顯示 PCR 循環(huán)數(shù)，y 軸顯示擴(kuò)增反應(yīng)的熒光（與管中擴(kuò)增產(chǎn)物的量成正比）。

  擴(kuò)增圖顯示兩個(gè)階段，指數(shù)階段，隨后是非指數(shù)平臺(tái)階段。在指數(shù)生長(zhǎng)期，PCR 產(chǎn)物的量在每個(gè)循環(huán)中大約翻倍。然而，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)組分被消耗，并且最終一種或多種組分變得有限。此時(shí)，反應(yīng)減慢并進(jìn)入平臺(tái)期（圖 1 中的循環(huán) 28-40）。

  最初，熒光保持在背景水平，并且即使產(chǎn)物呈指數(shù)累積，也無(wú)法檢測(cè)到熒光的增加（循環(huán) 1-18，圖 1）。最終，積累足夠的擴(kuò)增產(chǎn)物以產(chǎn)生可檢測(cè)的熒光信號(hào)。發(fā)生這種情況的循環(huán)數(shù)稱(chēng)為定量循環(huán)或 C q。由于 C q值是在試劑不受限制的指數(shù)期測(cè)量的，因此實(shí)時(shí) qPCR 可用于基于描述反應(yīng)進(jìn)程的已知指數(shù)函數(shù)可靠且準(zhǔn)確地計(jì)算反應(yīng)中存在的模板的初始量。

  反應(yīng)的C q主要由擴(kuò)增反應(yīng)開(kāi)始時(shí)存在的模板量決定。如果反應(yīng)開(kāi)始時(shí)存在大量模板，則需要相對(duì)較少的擴(kuò)增循環(huán)來(lái)積累足夠的產(chǎn)物以產(chǎn)生高于背景的熒光信號(hào)。因此，反應(yīng)的 C q較低或較早。相反，如果反應(yīng)開(kāi)始時(shí)存在少量模板，則需要更多的擴(kuò)增循環(huán)才能使熒光信號(hào)升至背景之上。因此，反應(yīng)將具有高或晚的 C q。這種關(guān)系構(gòu)成了實(shí)時(shí) PCR 定量方面的基礎(chǔ)。

  RNA分離

  樣品采集

  對(duì)于RNA 分離 和基因表達(dá)定量，樣品材料應(yīng)盡可能均勻。如果您的組織樣本由許多不同的細(xì)胞類(lèi)型組成，那么精確定位靶基因的表達(dá)模式可能會(huì)很困難。如果您有異質(zhì)樣品，請(qǐng)使用可用于分離和分離特定細(xì)胞類(lèi)型的多種方法之一，例如組織解剖、針活檢和激光捕獲顯微切割。然后可以使用收集的細(xì)胞來(lái)獲取 RNA 樣本。

  RNA 提取

  總 RNA 或 Poly(A+) RNA 可用于大多數(shù)實(shí)時(shí) RT-qPCR 應(yīng)用。使用 RNA 時(shí)的一項(xiàng)關(guān)鍵考慮因素是消除解決方案、耗材和實(shí)驗(yàn)室器具中的 RNase。您可以購(gòu)買(mǎi)即用型無(wú) RNase 溶液，也可以用焦碳酸二乙酯 (DEPC) 處理您的溶液，然后進(jìn)行高壓滅菌。實(shí)驗(yàn)室器具上的 RNase 也可以通過(guò) DEPC 處理或在 250°C 下烘烤 3 小時(shí)來(lái)滅活。

  制備的 RNA 樣品可能需要 DNase 處理，以防止任何污染基因組 DNA 的潛在擴(kuò)增，這可能導(dǎo)致高估 mRNA 的拷貝數(shù)。然而，當(dāng)起始材料有限時(shí)，DNA酶處理可能是不可取的，因?yàn)轭~外的操作可能會(huì)導(dǎo)致RNA損失。通過(guò)設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)錄特異性引物，例如跨剪接點(diǎn)或跨剪接點(diǎn)擴(kuò)增的引物，可以防止?jié)撛谖廴镜幕蚪MDNA的擴(kuò)增。

  分析核酸數(shù)量和質(zhì)量

  準(zhǔn)確的核酸定量對(duì)于基因表達(dá)分析至關(guān)重要，特別是當(dāng)使用總 RNA 量來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化靶基因表達(dá)時(shí)。RNA濃度和純度通常通過(guò)測(cè)量 260 nm 和 280 nm 處的 UV 吸光度比率來(lái)確定。

  逆轉(zhuǎn)錄定量 PCR (RT-qPCR)

  有兩種方法可用于通過(guò) RT-qPCR 定量基因表達(dá)：兩步 RT-qPCR 和一步 RT-qPCR。在這兩種情況下，RNA 都會(huì)逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，然后將 cDNA 用作 qPCR 擴(kuò)增的模板。一步和兩步是指RT和實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增是在同一管還是分開(kāi)的管中進(jìn)行。在兩步法中，RNA 首先在使用逆轉(zhuǎn)錄酶的反應(yīng)中轉(zhuǎn)錄成 cDNA。然后將所得 cDNA 的等分試樣用作多個(gè) qPCR 反應(yīng)的模板。在一步法中，RT 和 qPCR 在同一管中進(jìn)行。

  qPCR/實(shí)時(shí) PCR 儀器

  實(shí)時(shí) PCR 檢測(cè)系統(tǒng)由配備光學(xué)檢測(cè)模塊的熱循環(huán)儀組成，用于測(cè)量每個(gè)擴(kuò)增循環(huán)期間熒光團(tuán)與目標(biāo)序列結(jié)合時(shí)產(chǎn)生的熒光信號(hào)。Bio-Rad 實(shí)時(shí) PCR 檢測(cè)系統(tǒng) 配備帶有可互換模塊的熱循環(huán)儀，用于熒光團(tuán)的單重和多重檢測(cè)以及固定的實(shí)時(shí) PCR 單元。所有 qPCR 系統(tǒng)均具有熱梯度功能。