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【通蔚生物】:免疫ELISA試劑盒檢測法必須注意事項

發布時間:2023-10-19     發布作者:上海通蔚生物

目前考察ELISA試劑盒免疫法檢測試劑盒種類繁多,在實際檢測中發現,一般在試劑盒說明書中列出以下指標:檢測限;回收率;交叉反應率;標準曲線圖譜及數據,標準曲線至少由5個濃度組成;IC50測定值及變形曲線點數目的是比較規范的試劑盒,可以選擇。


1.臨界值(cut-off)的確定

在實際使用免疫法檢測時要首先確定臨界值。通過檢測結果與臨界值的比較,可判定樣品為陰性或可疑。對于禁用藥物,檢測方法的臨界值為定量限,即現有的公認的儀器檢測所能達到的定量限。對于有殘留限量(MRL)的藥物,檢測方法的臨界值為20份添加MRL濃度的樣品重復3次測定的均值減去1.64倍標準差。檢測結果如小于臨界值為陰性,大于或等于臨界值或標準規定為可疑,需要用確證法確證。 


2.檢測限的測定可添加MRL和MRL上下各一個濃度。

每個試驗室在使用免疫法檢測時,應做一下各自試驗室的檢測限。檢測限為20份空白樣品測定的均值加3倍標準差。如果經規范操作后所得檢測限大于臨界值時,說明試劑盒背景干擾大,試劑盒靈敏度不能滿足檢測要求,應與試劑盒廠家聯系或棄去不用選用另外的試劑盒。


3.免疫檢測方法驗證

在使用免疫法檢測樣品時,應對方法進行驗證。主要測定以下內容:
①標準曲線的測定,標準曲線至少由5個濃度組成,測定次數不少于5次,以確定工作濃度范圍和IC50范圍。一般臨界值為IC50附近,檢測靈敏度高。
②樣品檢測限的測定。
③樣品添加回收實驗。對禁用藥物可添加定量限和2倍定量限,對于有殘留限量(MRL)的藥物,可添加MRL和MRL上下各一個濃度。
準確度:若回收率大于40%符合相應檢測標準的要求。精密度:批內變異系數每批平行樣之間的變異系數小于或等于25%,對于禁用藥物小于或等于30%。批間變異系數所有樣品間變異系數小于或等于30%,對于禁用藥物小于或等于40%。滿足以上準確度和精密度要求,說明免疫方法可行,可用來檢測藥物殘留。


4.其他

①對于可用于多殘留檢測的ELISA試劑盒,以交叉反應率低的藥物做陽性添加測定臨界值(cut-off)。
②實際檢測樣品時要包括以下實驗:至少做兩條標準曲線,兩個陰性對照品,兩個添加臨界值(cut-off)的陽性對照品,兩個平行的待檢樣品。檢測結果出來后通過標準曲線形狀(符合檢測要求為S形),IC50與臨界值是否相近及陽性樣品回收率,樣品平行情況可確定檢測是否可信。
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