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酶聯(lián)免疫吸附測定的基本原理

發(fā)布時間:2023-11-16     發(fā)布作者:上海通蔚生物

  談起elisa,想必大家并不陌生,elisa又叫“酶聯(lián)免疫吸附試驗”。1971年elisa問世,是由瑞典科學(xué)家波爾諾斯(Per-?ke Persson)和克勞斯·克倫契(Claus K?hler)首次描述"固相酶聯(lián)免疫吸附試驗"。他們將酶與抗體或抗原結(jié)合到固定的固體表面上,實現(xiàn)了抗體和抗原的高度敏感和特異性檢測。下面由通蔚詳細(xì)給大家介紹一下elisa試劑盒原理。


elisa實驗原理

elisa實驗原理示意圖


  一、原理:免疫分析是一種利用特定抗體與抗原或半抗原發(fā)生的高選擇性高特異性識別和結(jié)合原理,對待測抗體或者抗原進行分析測定的方法,酶聯(lián)免疫吸附分析(下稱ELISA)是免疫分析的一種,分三個部分組成:免疫識別,信號輸出和數(shù)據(jù)處理。

  二、步驟:免疫識別是在聚苯乙烯制成的96孔板上包被抗體,而后利用抗體識別待測的抗原(通常是疾病的蛋白質(zhì)生物標(biāo)記物,病毒,細(xì)菌等等,從復(fù)雜待測液中將抗原吸附到96孔板表面。接著用帶有辣根過氧化酶(Horseradish Peroxidase, HRP)、熒光或放射性標(biāo)記的抗體通過直接或者間接的方式輸出識別信號。最后利用信號強度,標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度梯度等信息計算得出待測樣中目標(biāo)抗原的濃度。

  根據(jù)免疫識別和信號輸出方式的不同,ELISA可以分為雙抗體夾心法、直接免疫競爭法和非直接免疫競爭法等等。其中雙抗體夾心法在商業(yè)應(yīng)用上最常見。

  雙抗體夾心法:


       ①:抗體包被 在96孔板上包被抗體。由于酶標(biāo)板是由聚苯乙烯制成,其含有的苯環(huán)與抗體的氨基酸殘基具有類似π-π堆積作用的引力,結(jié)合靜電和疏水作用,可以將抗體吸附于其表面。然后,將未吸附的抗體用緩沖液清洗后,加入含有明膠或牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA)的封閉液以封閉酶標(biāo)板上未結(jié)合抗體的部分。加入封閉液的目的,是防止其他蛋白因靜電或疏水作用吸附在96孔板上,造成假陽性信號,干擾后續(xù)實驗的進行。

  ②:免疫識別 在96孔板上包被抗體后,加入待測樣,并在37°C環(huán)境下孵育一段時間,通常是1-2小時。此時酶標(biāo)板上的抗體與待測抗原進行特異性識別結(jié)合。此處抗體的質(zhì)量是關(guān)鍵,好的抗體既能特異性高效地結(jié)合抗原又不受待測樣中其他生物大分子、蛋白質(zhì)和無機鹽等成分的影響。

  ③:洗板 將未結(jié)合的抗原洗掉,加入該抗原所對應(yīng)的識別抗體并在37°C下繼續(xù)培養(yǎng)1-2小時,接著將未連接上抗原的抗體洗掉。

  ④:酶標(biāo)信號輸出 加入帶有辣根過氧化酶(Horseradish Peroxidase, HRP)標(biāo)記的酶標(biāo)二抗,用于和標(biāo)準(zhǔn)抗體結(jié)合。在培養(yǎng)30分鐘后洗掉未連接的二抗,并加入顯色劑顯色。根據(jù)顯色的結(jié)果判斷抗原的濃度。一般認(rèn)為,抗原濃度與顯色后的發(fā)光強度呈正相關(guān)。
雙抗體夾心法


雙抗體夾心法原理示意圖

 免疫競爭法


  以抗原競爭抗體為例,在上述免疫夾心法操作步驟的第二步加入待測抗原后,立刻加入酶標(biāo)抗原,使之與待測抗原競爭識別酶標(biāo)板上的抗體。當(dāng)待測抗原濃度越高,能夠連上酶標(biāo)板上抗體的酶標(biāo)抗體就越少,輸出的信號就越少。這樣待測樣濃度與酶顯色信號就呈逆相關(guān)。

競爭ELISA原理

競爭ELISA原理示意圖


  上述為大家介紹“酶聯(lián)免疫吸附實驗”的基本原理,希望通過這些原理可以讓您更加明白和認(rèn)識elisa實驗步驟。上海通蔚生物一直致力于為廣大高校、科研院所和企事業(yè)單位提供一流的科研試劑和完善的技術(shù)服務(wù),滿足生物化學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)等生物科技實驗需求。
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