發(fā)布時間:2023-06-28 發(fā)布作者:上海通蔚生物
有機(jī)小分子
有機(jī)小分子如熒光素(MW=389 D)、Alexa Fluor 488(熒光素類似物)、Texas Red (325 D)、Alexa Fluor 647 (1464 D)、Pacific Blue和Cy5 (762 D)通常用于抗體偶聯(lián)。它們具有一致的發(fā)射光譜,但有一個小的Stokes位移(激發(fā)波長和發(fā)射波長之間的差,約50-100 nm)。有機(jī)小分子很穩(wěn)定,且很容易與抗體結(jié)合。目前,一些染料(例如Alexa Fluor, Thermo Fisher)經(jīng)過特殊設(shè)計,可減小成像時的光漂白效應(yīng),是樣品需要成像分析時更好的試劑選擇。
藻膽蛋白
藻膽蛋白是來源于藍(lán)藻、鞭毛藻等藻類的大型蛋白質(zhì)分子。藻膽蛋白的分子量大(例如藻紅素(PE)的分子量為240kD),非常適合于定量流式細(xì)胞術(shù),因?yàn)樗鼈冊谂悸?lián)過程中通常有1:1的蛋白質(zhì)與熒光色素比例。藻膽蛋白具有較大的Stokes位移(75-200 nm)和穩(wěn)定的發(fā)射光譜。然而,藻膽蛋白易受光漂白效應(yīng)影響,不建議長時間或反復(fù)暴露于激發(fā)光源。常用的藻膽蛋白有藻紅蛋白(PE),藻藍(lán)蛋白(APC)和葉綠素蛋白(PerCP)等。
量子點(diǎn)
量子點(diǎn) (Qdots) 是半導(dǎo)體納米晶體,具有與納米晶體尺寸相關(guān)的緊密熒光發(fā)射光譜。它們最適合用紫外或紫色激光激發(fā),但也可能被多個激光最低限度地激發(fā)。當(dāng) Qdots 用于多參數(shù)實(shí)驗(yàn)時,這種最小激發(fā)使熒光補(bǔ)償復(fù)雜化。由于補(bǔ)償問題和難以結(jié)合抗體,Qdots在多參數(shù)染色面板中已在很大程度上被聚合物染料取代。
高分子聚合物染料
聚合物染料由收集光信號的聚合物鏈組成,可以根據(jù)聚合物鏈的長度和連接的分子亞基,吸收和發(fā)射特定波長的光。聚合物染料非常穩(wěn)定,具有與藻膽蛋白相似的量子效率,且光穩(wěn)定性大大提高。由于聚合物染料只能吸收特定波長的光,因此避免了量子點(diǎn)試劑在多參數(shù)實(shí)驗(yàn)中難以進(jìn)行多次激光激發(fā)的問題。常見的聚合物染料有亮紫(BV)、亮紫外(BUV)和亮藍(lán)(BB)試劑。
串聯(lián)染料
串聯(lián)染料由藻膽蛋白(PE、APC、PerCP)或聚合物染料(BV421、BUV395)與小的有機(jī)熒光染料(Cy3、Cy5、Cy7)化學(xué)偶聯(lián)而成,可用單個激光源進(jìn)行激發(fā),這種染料增加了可由單個激光激發(fā)的熒光染料的種類。例如,Texas Red的最大激發(fā)波長為589 nm,PE的發(fā)射波長為585 nm,因此通過將PE偶聯(lián)到Texas Red, PE的發(fā)射光通過熒光能量轉(zhuǎn)移(FRET)激發(fā)Texas Red,使PE-TxRed串聯(lián)染料可以被488 nm或532 nm激光激發(fā)。聚合物鏈抗體使用相同的方法來增加可由單個激光激發(fā)的熒光染料。串聯(lián)染料非常明亮,具有較大的Stokes位移值 (150-300 nm),這在處理低抗原密度樣本時非常有用。然而,串聯(lián)染料的穩(wěn)定性不如供體熒光染料,而且它們的能量轉(zhuǎn)移效率因批次而異,使補(bǔ)償變得復(fù)雜。大多數(shù)較長的Brilliant聚合物染料也是串聯(lián)的,也存在上述問題。