酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）是目前免疫實(shí)驗(yàn)較為靈敏、可重復(fù)的技術(shù)之一。它快速、簡(jiǎn)單易于自動(dòng)化。與其它實(shí)驗(yàn)一樣，ELISA實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性和可靠性取決于適當(dāng)?shù)募夹g(shù)和細(xì)節(jié)的關(guān)注。

  ELISA常見的技術(shù)類型

  ELISA常見的技術(shù)類型分為直接ELISA、間接ELISA和夾心ELISA。

•   直接ELISA，其中抗原固定在ELISA板上，并且一抗帶有標(biāo)記（圖1A）

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•   間接ELISA，其中抗原固定在ELISA板上，二抗帶有標(biāo)記（圖1B）
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•   夾心ELISA，其中兩種一抗（用于捕獲和檢測(cè)）嵌入抗原，形成“夾心”，然后復(fù)合物被二抗識(shí)別（圖1C）。
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  ELISA試劑盒中匹配的抗體對(duì)

  配對(duì)抗體是指已知可識(shí)別同一蛋白質(zhì)抗原上的不同表位的抗體組，因此它們可以一起用于在夾心ELISA中捕獲和檢測(cè)單一抗原。ELISA檢測(cè)中使用的抗體可以是單克隆抗體、多克隆抗體或兩者的組合。

  單克隆抗體可用于所有類型的ELISA中所有含抗體的步驟。它們通常以匹配對(duì)的形式成套用于夾心ELISA，但可以與多克隆抗體一起用于捕獲或檢測(cè)，以增強(qiáng)信號(hào)或提供更大的機(jī)會(huì)從復(fù)雜溶液中捕獲抗原。

  由于多克隆抗體溶液中存在的抗體異質(zhì)性以及表位的廣泛代表性，多克隆抗體可以成為檢測(cè)抗原的有力工具，通常比單克隆抗體產(chǎn)生更高的信號(hào)水平。然而，多克隆抗體更有可能與密切相關(guān)的蛋白質(zhì)共享一個(gè)或多個(gè)表位，從而產(chǎn)生更高的非特異性信號(hào)。減少此問(wèn)題的一種方法是使用親和力純化或交叉吸收的多克隆抗體。為了提高檢測(cè)靈敏度，ELISA的檢測(cè)方法可以從直接檢測(cè)轉(zhuǎn)換為使用多克隆抗體的間接檢測(cè)。相關(guān)閱讀：《單克隆 vs 多克隆抗體：科研實(shí)驗(yàn)中的抉擇》

  ELISA樣本

  ELISA可以檢測(cè)多種樣本，檢測(cè)條件的選擇取決于樣本的復(fù)雜性和預(yù)期存在的抗原量。

  重要的是，要結(jié)合已知標(biāo)準(zhǔn)對(duì)所有樣本進(jìn)行兩次或三次測(cè)試，以確保結(jié)果和定量的準(zhǔn)確性。最好對(duì)樣本進(jìn)行多次稀釋測(cè)試，以確保最終結(jié)果在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性部分內(nèi)。高濃度樣本可能會(huì)低估濃度，而高度稀釋的樣本可能會(huì)高估濃度。

  ELISA封閉和清洗步驟

  封閉通常是必要的，以防止檢測(cè)抗體與多孔板表面本身的非特異性結(jié)合。當(dāng)板完全封閉時(shí)，檢測(cè)靈敏度將增強(qiáng)，因?yàn)榉翘禺愋孕盘?hào)將減少。

  徹底清洗程序?qū)τ讷@得可靠的ELISA結(jié)果至關(guān)重要。重要的是，通過(guò)輕輕將吸液頭放入底部，將所有孔中的液體完全吸出。避免刮傷孔內(nèi)。清洗完成后，建議將板倒置并用吸水紙擦干。

  如何優(yōu)化您的ELISA實(shí)驗(yàn)

  ELISA實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性有助于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，下面結(jié)合日常ELISA實(shí)驗(yàn)操作來(lái)優(yōu)化幾點(diǎn)建議：

  1）捕獲抗體濃度

  在包被緩沖液中制備不同濃度的捕獲抗體。

  2）阻斷緩沖液

  準(zhǔn)備不同的封閉液。如果封閉液不是預(yù)先配制的（即它是單一蛋白質(zhì)，例如BSA），請(qǐng)嘗試不同濃度的蛋白質(zhì)。

  3）標(biāo)準(zhǔn)稀釋劑

  嘗試使標(biāo)準(zhǔn)稀釋劑與樣品基質(zhì)盡可能接近匹配。

  如果基質(zhì)本身無(wú)法精確復(fù)制，則測(cè)試不同的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液，并檢查樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線和稀釋線性。可能需要選擇不同的稀釋劑。

  如果樣品的線性較差，則樣品基質(zhì)和標(biāo)準(zhǔn)稀釋劑之間可能存在不平衡。在這種情況下，應(yīng)進(jìn)行加標(biāo)回收或稀釋線性實(shí)驗(yàn)。

  4)樣品濃縮

  制備不同濃度的樣品，注意底物的檢測(cè)限。為了確認(rèn)生物樣品基質(zhì)不會(huì)掩蓋或增強(qiáng)信號(hào)，應(yīng)進(jìn)行加標(biāo)回收和稀釋線性實(shí)驗(yàn)。

  5）檢測(cè)抗體濃度

  制備不同濃度的檢測(cè)抗體。

  6）酶結(jié)合物濃度

  根據(jù)ELISA試劑盒中針對(duì)底物描述的范圍，制備不同濃度的酶結(jié)合物。

  7）信號(hào)檢測(cè)

  根據(jù)樣品中的抗原量以及用平板讀取器檢測(cè)的能力來(lái)選擇底物。

  如果可以清楚地檢測(cè)到抗原則表明底物是合適的。

  如果抗原低于檢測(cè)閾值，則選擇更敏感的底物。

  常見的ELISA問(wèn)題

  下面上海通蔚為大家匯總了常見ELISA問(wèn)題，了解這些問(wèn)題有助于后期在實(shí)驗(yàn)中減少出錯(cuò)的概率。

  1)ELISA檢測(cè)信號(hào)弱或無(wú)信號(hào)

  建議在開始檢測(cè)前將所有試劑放置于室溫下15-20分鐘。

  組件儲(chǔ)存不正確。仔細(xì)檢查試劑盒標(biāo)簽上的儲(chǔ)存條件。大多數(shù)試劑盒需要儲(chǔ)存在2–8oC的環(huán)境中。

  試劑添加/制備不正確。檢查方案，確保試劑以正確的順序添加，并準(zhǔn)備正確的稀釋度。

  熒光試劑過(guò)度曝光。強(qiáng)光會(huì)分解熒光團(tuán)，導(dǎo)致光漂白。保護(hù)熒光團(tuán)免受光照對(duì)于在檢測(cè)結(jié)束時(shí)有效產(chǎn)生信號(hào)至關(guān)重要。

  組分需要進(jìn)一步優(yōu)化。檢測(cè)的某一組分可能處于限制濃度，導(dǎo)致整體信號(hào)較低。

  試劑降解。其中一種試劑可能已降解或被污染，這種情況下應(yīng)予以更換。

  抗體配對(duì)效率低或?qū)Π袠?biāo)缺乏足夠的親和力。所用的抗體可能無(wú)法有效地與抗原結(jié)合，或可能無(wú)法相互結(jié)合發(fā)揮作用。在這種情況下，必須測(cè)試替代抗體。

  檢測(cè)系統(tǒng)需要進(jìn)一步優(yōu)化。檢測(cè)系統(tǒng)（底物）可能不夠靈敏，無(wú)法發(fā)出信號(hào)，或者標(biāo)準(zhǔn)曲線可能不適合該樣品。可能需要濃縮樣品或切換到更靈敏的底物。

  2）背景高

  清洗或封閉不充分。高背景信號(hào)通常是由于清洗或封閉不充分、樣品成分或抗體與封閉緩沖液發(fā)生交叉反應(yīng)，或者使用了過(guò)多的酶結(jié)合物造成的。

  平衡產(chǎn)生特定信號(hào)的酶量與產(chǎn)生背景信號(hào)的酶量非常重要。控制這一點(diǎn)的最有效方法是優(yōu)化酶結(jié)合物、抗體和封閉液。

  3）標(biāo)準(zhǔn)曲線線性差

  如果標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性較差，則樣品必須在嚴(yán)格的濃度范圍內(nèi)才被視為準(zhǔn)確的。

  如果曲線具有良好的線性，但重復(fù)之間的變化較差（即標(biāo)準(zhǔn)誤差），則可能存在技術(shù)問(wèn)題，例如樣品或個(gè)人用戶之間的移液不一致。

  為了緩解此問(wèn)題，應(yīng)至少對(duì)所有樣品和標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行兩次或三次測(cè)量。

  4)ELISA信號(hào)過(guò)高

  清洗不充分。為了避免此問(wèn)題，請(qǐng)使用適當(dāng)?shù)那逑闯绦颍纾诿總€(gè)清洗步驟結(jié)束時(shí)，將板倒置在吸水紙上并使其完全排干，必要時(shí)用力拍打以去除任何殘留液體。

  孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)也是ELISA信號(hào)過(guò)高的原因之一；務(wù)必遵循建議的孵育時(shí)間。

  污染。使用板密封劑可避免此問(wèn)題，每次打開板時(shí)都使用新的密封劑。這將防止孔相互污染。