ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測定）是實(shí)驗(yàn)室中使用的一種免疫測定方法，用于檢測和定量血清或血液樣本的復(fù)雜混合物中的可溶性物質(zhì)，例如肽、蛋白質(zhì)和抗體。該測定也稱為酶免疫測定（EIA）。
  
  在此測定中，抗原或抗體被固定在 ELISA 板的表面，分析物在板中孵育以與靶標(biāo)結(jié)合。然后通過提供特定的生理條件來洗脫抗原-抗體復(fù)合物。
  
  ELISA檢測的整個過程可分為三個階段：
  
  1、包被/捕獲：將特異性抗原固定在96孔板的表面。通常捕獲抗體被固定在表面上以捕獲目標(biāo)抗原。
  
  2、板封閉：為了避免背景信號并確保目標(biāo)抗原和特異性抗體之間的有效結(jié)合，板的剩余表面用一些蛋白質(zhì)覆蓋。
  
  3、探測/檢測：將含有反應(yīng)混合物的 ELISA 板與與目標(biāo)抗原結(jié)合的抗原特異性抗體一起孵育。酶聯(lián)檢測抗體用于產(chǎn)生顯示測試樣品中存在的抗原/分析物量的信號。
  
  ELISA測定中使用的檢測抗體是傳統(tǒng)的單克隆抗體、多克隆抗體或重組單克隆抗體。此外，在測定過程中要確保的一件事是捕獲抗體和檢測抗體都必須識別不重疊的表位。
  
  ELISA 方案中經(jīng)常涉及的酶綴合物包括 β-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶 (AP)、辣根過氧化物酶 (HRP) 和過氧化氫酶。它們與特定的底物結(jié)合以產(chǎn)生可檢測的信號范圍。
  
  4、信號測量：使用讀板機(jī)讀取目標(biāo)抗原和抗體之間反應(yīng)產(chǎn)生的信號量。獲得的數(shù)據(jù)可以是定量的、半定量的和定性的。在定量研究中，濃度結(jié)果根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制，該曲線將光密度與對數(shù)濃度進(jìn)行比較。
  
  在本文中，上海通蔚生物將介紹四種常見類型的 ELISA 方法以及免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室中用于一系列研究應(yīng)用的檢測技術(shù)。
  

  ELISA 有哪些類型？

  
  ELISA檢測主要有四種類型：
  
  1. 直接 ELISA
  
  直接 ELISA 技術(shù)涉及將抗原固定在聚苯乙烯微孔板上，然后使用蛋白質(zhì)（例如抑肽酶、卵清蛋白、BSA 或任何其他動物蛋白）封閉微孔板。然后，洗滌板并與一抗一起孵育。
  

  在此測定中，一抗直接與底物（例如 HRP 或 AP）結(jié)合，導(dǎo)致顏色變化。由于過程中只涉及較少的步驟，直接 ELISA 是一種適用于實(shí)驗(yàn)室工作流程的快速技術(shù)，同時還消除了二抗交叉反應(yīng)。但其缺點(diǎn)是反應(yīng)靈敏度低、成本低。

  
  
  2. 間接 ELISA
  
  該技術(shù)的步驟與直接 ELISA 類似。唯一的區(qū)別是涉及額外的洗滌步驟以及該過程中使用的抗體類型。
  
  間接 ELISA工作流程中  涉及兩種類型的抗體：一抗和二抗。
  
  首先添加一抗并洗滌，然后與標(biāo)記的二抗一起孵育。
  

  間接 ELISA 的優(yōu)點(diǎn)是成本較低、更加靈敏和靈活。然而，由于二抗的存在，檢測過程中存在交叉反應(yīng)的可能性。

圖：間接 ELISA 涉及的步驟

  
  3. 三明治 ELISA
  
  在此測定中，抗原夾在兩種抗體之間。這就是該測定被稱為夾心 ELISA 的原因。該測定首先使用捕獲抗體包被微孔板表面，用 BSA 封閉表面，然后向微孔板中添加抗原，持續(xù)約 90 分鐘。
  
  孵育步驟后，用緩沖液清洗板，然后與標(biāo)記的二抗一起孵育。然后，添加底物來研究和測量反應(yīng)信號。
  

  盡管夾心 ELISA 具有最高的靈敏度，但其主要缺點(diǎn)是該過程所需的時間和費(fèi)用。此外，尋找完美抗原抗體對的必要性也是該測定的限制。

  
  4. 競爭性 ELISA
  
  該測定檢測測試樣品中抗原特異性抗體的存在。它涉及使用兩種抗體：樣品中存在的抗體和酶聯(lián)抗體。它們在反應(yīng)過程中競爭抗原。沒有顏色代表陽性測試結(jié)果，而有顏色則代表陰性測試結(jié)果。
  

  該測定法不能用于經(jīng)過任何程度稀釋的樣品，并且靈敏度較低。然而，它有許多優(yōu)點(diǎn)，例如需要較少的樣品純化、較小的變異性以及分析樣品中的一系列抗原。

圖：競爭 ELISA 涉及的步驟說明

  

  常用的ELISA檢測方法有哪些？

  
  在 ELISA 中，經(jīng)常使用與特定抗原結(jié)合的標(biāo)記抗體。因此，當(dāng)將能夠轉(zhuǎn)化酶的底物添加到反應(yīng)混合物中時，會引起溶液顏色的變化。使用檢測方法來檢測或分析信號。
  
  根據(jù)酶和底物的不同，ELISA 檢測中的檢測方法差異很大。如今，還有許多 ELISA 試劑盒可讓您輕松進(jìn)行 ELISA 測定。但是，它不包含執(zhí)行檢測所需的通用試劑，例如 tween-20、磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS)、封閉緩沖液、洗滌緩沖液等。
  
  目前有許多檢測方法可用于研究抗原抗體復(fù)合物之間的反應(yīng)，例如比色法、熒光法、化學(xué)發(fā)光法和顯色法。然而，下面介紹了其中最常見的三種。
  
  1、化學(xué)發(fā)光分析
  
  該技術(shù)利用過氧化物酶偶聯(lián)的檢測抗體，例如 HRP 和 AP。基于魯米諾的溶液用作形成反應(yīng)產(chǎn)物的底物，發(fā)射光子，可以使用光度計讀取光子。
  
  與其他檢測方法相比，該技術(shù)具有超靈敏性，具有更寬的動態(tài)范圍，甚至可以檢測給定樣品中最少量的分析物。
  
  2、顯色測定
  
  顯色法是ELISA檢測方法中最常見的類型之一。它涉及使用辣根過氧化物酶 (HRP-) 或堿性磷酸酶 (AP-) 標(biāo)記的抗體與顯色底物（例如四甲基聯(lián)苯胺 (TMB) 溶液）結(jié)合使用。
  
  該技術(shù)利用反應(yīng)的吸光度來確定讀數(shù)，用于比較樣品或根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測感興趣分子的濃度。
  
  3、熒光分析
  
  該技術(shù)將過氧化物酶偶聯(lián)的檢測抗體（例如 HRP 和 AP）與暴露于某些光波長時發(fā)出熒光的熒光底物相結(jié)合。即使分析物濃度較高，信號也不會飽和，并提供更準(zhǔn)確的結(jié)果。
  
  總的來說，Elisa是一種靈敏、特異、快速的檢測方法，廣泛應(yīng)用于生物科學(xué)、醫(yī)學(xué)和食品安全等領(lǐng)域。盡管Elisa具有許多優(yōu)點(diǎn)，但也存在一些限制，例如對于某些特定的檢測目標(biāo)，可能存在交叉反應(yīng)或假陽性結(jié)果。因此，在實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)根據(jù)具體需求和目標(biāo)選擇適當(dāng)?shù)臋z測方法，并對其進(jìn)行合理評估和優(yōu)化。隨著科技的不斷發(fā)展，Elisa技術(shù)也將不斷完善和進(jìn)步，為人類的生活和科學(xué)研究提供更多幫助。