發(fā)布時(shí)間:2024-04-26 發(fā)布作者:上海通蔚生物
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種相對簡單且廣泛使用的分子生物學(xué)技術(shù),用于擴(kuò)增和檢測DNA和RNA序列。與傳統(tǒng)的DNA克隆和擴(kuò)增方法相比,PCR只需要數(shù)小時(shí),具有快速、高效和特異性強(qiáng)。因?yàn)閷?shí)驗(yàn)需求,目前在PCR基礎(chǔ)上改進(jìn)。大家在實(shí)驗(yàn)中還接觸到了RT-PCR和qPCR。今天,上海通蔚給大家來介紹一下它們之間的區(qū)別。
聚合酶鏈反應(yīng),也就是PCR(polymerasechainreaction)技術(shù),這是一種使用DNA聚合酶拷貝選定DNA區(qū)域的技術(shù),由KaryMullis及同事在20世紀(jì)80年代發(fā)明,KaryMullis也因此被授予了諾貝爾化學(xué)獎。PCR常用于基因克隆、基因分析、基因診斷、DNA指紋識別等領(lǐng)域。
PCR實(shí)驗(yàn)前需要 DNA聚合酶、鎂、核苷酸、引物、待擴(kuò)增的DNA模板和熱循環(huán)儀。PCR由三個步驟組成:變性-退火-延伸。
模版DNA變性:雙鏈DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后,使其解離使之成為單鏈,以便它與引物結(jié)合,為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備;
模板DNA與引物的退火(復(fù)性):模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié);
引物的延伸:DNA模板-引物結(jié)合物在72℃、DNA聚合酶(如Taq DNA聚合酶)的作用下,以dNTP為反應(yīng)原料,靶序列為模板,按堿基互補(bǔ)配對與半保留復(fù)制原理,合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。經(jīng)過一系列溫度和時(shí)間的變性、退火和延伸過程稱為一個擴(kuò)增循環(huán)。循環(huán)的每個步驟都應(yīng)針對所使用的模板和引物組進(jìn)行優(yōu)化。該循環(huán)重復(fù)大約20-40次,然后通常通過瓊脂糖凝膠分析擴(kuò)增產(chǎn)物。
圖1 PCR擴(kuò)增示意圖
逆轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscription PCR)或者稱反轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscription-PCR,RT-PCR),是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的一種廣泛應(yīng)用的變形。RT-PCR靈敏度高,操作簡單,常用于基因表達(dá)分析、病毒檢測、RNA 病毒的定量等領(lǐng)域等。
RT-PCR和PCR區(qū)別在于它是從mRNA模版開始,在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下,隨機(jī)引物、oligo(dT)或基因特異性引物的引導(dǎo)下合成互補(bǔ)的DNA(complementaryDNA,cDNA),按照普通PCR的方法用兩條引物以cDNA為模板,則可擴(kuò)增出不含內(nèi)含子的可編碼完整基因的序列。
圖2 逆轉(zhuǎn)錄RT-PCR原理圖
qPCR實(shí)時(shí)定量PCR(real-timePCR)是是一種在DNA擴(kuò)增時(shí)(即實(shí)時(shí))對其定量的方法,常用于基因表達(dá)定量、病原體檢測、基因分型。與普通PCR一樣,DNA通過三個重復(fù)步驟進(jìn)行擴(kuò)增:變性、退火和延伸。在qPCR中,熒光標(biāo)記可以隨著PCR的進(jìn)展收集數(shù)據(jù)。由于可用的方法和化學(xué)物質(zhì)范圍廣泛,該技術(shù)具有許多優(yōu)點(diǎn)。在基于染料的qPCR(通常為綠色)中,熒光標(biāo)記允許通過使用dsDNA結(jié)合染料對擴(kuò)增的DNA分子進(jìn)行定量。在每個循環(huán)期間,測量熒光。熒光信號隨復(fù)制DNA的數(shù)量成比例增加。
圖3 qPCR實(shí)時(shí)定量原理圖
上述為大家介紹了PCR、RT-PCR和qPCR區(qū)別,選擇哪種技術(shù)取決于實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮托枨蟆?/span> 如果只需要確定是否存在特定 DNA 或 RNA 序列,可以選擇 PCR 或 RT-PCR;如果需要精確量化起始模板的含量,則 qPCR 是更好的選擇。關(guān)于PCR還有疑問,歡迎前來咨詢。上海通蔚有上述三種技術(shù)的PCR試劑盒,對PCR試劑盒有需要的歡迎前來咨詢,我們PCR試劑盒快速、高效、特異性強(qiáng)。