了解如何冷凍細(xì)胞是從事生物醫(yī)學(xué)研究人員必不可少的知識(shí)。研究人員通常會(huì)冷凍原代細(xì)胞和細(xì)胞系，以便靈活安排實(shí)驗(yàn)時(shí)間并保持細(xì)胞質(zhì)量。冷凍細(xì)胞庫(kù)可確保檢測(cè)結(jié)果的可重復(fù)性，并在細(xì)胞培養(yǎng)物受到污染或丟失時(shí)提供備用細(xì)胞來(lái)源。

  冷凍細(xì)胞是一個(gè)較為復(fù)雜過(guò)程，由于水是活細(xì)胞中最重要的成分，當(dāng)水結(jié)冰時(shí)，細(xì)胞代謝就會(huì)停止。經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)慕鈨龀绦蚝?，?xì)胞會(huì)恢復(fù)正常的生物活動(dòng)。

  冷凍保存細(xì)胞有許多優(yōu)點(diǎn)，但由于細(xì)胞暴露在冷凍保護(hù)劑中并且冷凍所需的低溫下，該過(guò)程可能會(huì)給細(xì)胞帶來(lái)壓力。上海通蔚為大家介紹大多數(shù)細(xì)胞冷凍方案。

  選擇正確的冷凍介質(zhì)

  選擇正確的冷凍培養(yǎng)基取決于細(xì)胞系和應(yīng)用，并且需要進(jìn)行優(yōu)化以確保解凍后最高的活力。

  對(duì)于大多數(shù)應(yīng)用，應(yīng)該考慮使用生長(zhǎng)培養(yǎng)基血清或市售的冷凍培養(yǎng)基，例如二甲基亞砜（DMSO）。在開(kāi)始細(xì)胞冷凍方案之前，請(qǐng)確保您已經(jīng)準(zhǔn)備好適合懸浮細(xì)胞的溫度和體積的冷凍培養(yǎng)基。

  在進(jìn)入冷凍程序之前，請(qǐng)記住在與細(xì)胞混合后多次上下吹打培養(yǎng)基以確保單細(xì)胞懸浮。此外，最好不要將懸浮液倒入低溫小瓶中，因?yàn)檫@將大大增加污染風(fēng)險(xiǎn)。

  低溫瓶和標(biāo)簽

  用于冷凍細(xì)胞的任何小瓶都應(yīng)適合低溫應(yīng)用。這些小瓶應(yīng)由聚丙烯制成，可承受低至-196°C的溫度。使用聚酯低溫小瓶和可耐受超低溫的粘合劑為您的小瓶貼上標(biāo)簽。在粘貼到小瓶之前，請(qǐng)?jiān)跇?biāo)簽上打印所有重要信息，例如日期、細(xì)胞類(lèi)型、識(shí)別號(hào)和濃度。

  細(xì)胞冷凍率和長(zhǎng)期儲(chǔ)存

  將細(xì)胞分裝到貼有適當(dāng)標(biāo)簽的低溫小瓶中后，即可開(kāi)始冷凍程序。與解凍細(xì)胞不同，冷凍過(guò)程是一個(gè)緩慢、可控的過(guò)程。讓冷凍保護(hù)劑有時(shí)間從細(xì)胞中去除水分至關(guān)重要，這可以降低因冰晶形成而造成損害的風(fēng)險(xiǎn)。

  當(dāng)細(xì)胞被快速冷凍時(shí)，水和離子往往會(huì)留在細(xì)胞中。這最大限度地減少了溶質(zhì)濃度效應(yīng)和脫水。然而，細(xì)胞內(nèi)的冰形成會(huì)通過(guò)撕裂和刺穿細(xì)胞膜造成嚴(yán)重?fù)p害。相反，如果細(xì)胞緩慢冷凍，細(xì)胞外的水會(huì)在細(xì)胞內(nèi)冰形成之前結(jié)冰。這允許水通過(guò)滲透逸出，但會(huì)增加細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)的濃度，而這可能是有毒的。

  實(shí)際上，非常快和非常慢的冷凍速度都會(huì)導(dǎo)致過(guò)量冰形成或溶質(zhì)毒性增加。DMSO等冷凍保護(hù)劑可促進(jìn)脫水、減少冰結(jié)晶并降低溶質(zhì)效應(yīng)。對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞來(lái)說(shuō)，最佳冷凍速度是每分鐘1°C。正如您在圖表中看到的，在這個(gè)溫度范圍內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)冰形成的負(fù)面影響與溶質(zhì)濃度的增加達(dá)到平衡。

  這將使細(xì)胞活力達(dá)到最大。

  冷凍細(xì)胞通常是一個(gè)兩步過(guò)程，其中細(xì)胞以緩慢、可控的速率冷卻至-80°C，然后在-135°C或更低的溫度下長(zhǎng)期儲(chǔ)存。

  步驟1：以控制的速率將細(xì)胞冷凍至-80°C

  如前所述，必須使用控速冷凍機(jī)或控速容器將細(xì)胞以每分鐘約-1°C的速率冷卻至-80°C。

  將凍存瓶放入容器后，可將其放入-80°C冰箱中過(guò)夜。12小時(shí)后，凍存瓶即可轉(zhuǎn)移至液氮冰箱中進(jìn)行長(zhǎng)期保存。

  值得注意的是，應(yīng)避免將細(xì)胞在-80°C冰箱中儲(chǔ)存超過(guò)兩周。在此溫度下儲(chǔ)存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡和樣品活力降低。

  步驟2：在液氮中長(zhǎng)期儲(chǔ)存

  液氮儲(chǔ)存方法有兩種基本類(lèi)型。一種是將小瓶直接浸入液體中。另一種是將小瓶置于液體上方的氣相中。

  氣相系統(tǒng)在容器內(nèi)形成垂直溫度梯度。在底部，液氮將保持約-196°C的溫度。

  氣相溫度在到達(dá)容器頂部時(shí)會(huì)升高。應(yīng)使用足夠的液氮，以確保罐頂部最熱部分的溫度始終低于-135°C。

  我們建議將小瓶?jī)?chǔ)存在氣相中，而不是液相中。代謝活動(dòng)在-135°C時(shí)停止，而液相的額外低溫并沒(méi)有帶來(lái)真正的好處。

  事實(shí)上，將小瓶浸入液相中存在部分液氮可能滲透并損壞小瓶的風(fēng)險(xiǎn)。

  對(duì)于從事免疫學(xué)、毒理學(xué)和其他科學(xué)領(lǐng)域的研究人員和實(shí)驗(yàn)室工作人員來(lái)說(shuō)，學(xué)習(xí)如何冷凍細(xì)胞并使其在解凍后保持最大活力是一項(xiàng)重要技能。

  總而言之，制定細(xì)胞冷凍方案時(shí)主要考慮三個(gè)因素：冷凍介質(zhì)的類(lèi)型和濃度、低溫小瓶的類(lèi)型、最佳冷凍速度和長(zhǎng)期儲(chǔ)存溫度。

  最好使用含有冷凍保護(hù)劑（如DMSO）的冷凍介質(zhì)來(lái)冷凍健康且可存活的細(xì)胞。

  冷凍培養(yǎng)基細(xì)胞濃度取決于細(xì)胞和應(yīng)用，因此需要進(jìn)行優(yōu)化以實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期儲(chǔ)存。

  低溫瓶應(yīng)帶有外螺紋，額定溫度為-196°C。

  冷凍細(xì)胞時(shí)，確?？刂评鋮s速度為-1°C/min，直至達(dá)到-80°C，然后轉(zhuǎn)移到液氮罐的氣相中進(jìn)行長(zhǎng)期儲(chǔ)存。