巨噬細(xì)胞是適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵細(xì)胞，與許多疾病有關(guān)。可以使用巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞系（如小鼠RAW264.7系）在體外研究它們。然而，細(xì)胞系是永生化的，通常不能反映細(xì)胞的典型功能。可以從小鼠骨髓中提取和培養(yǎng)原代巨噬細(xì)胞，并將其分化為骨髓衍生巨噬細(xì)胞(BMDM)。BMDM代表了巨噬細(xì)胞功能的更準(zhǔn)確模型。由于原代細(xì)胞可能難以處理，我們整理了一些實(shí)驗(yàn)技巧。

  以下是成功提取和培養(yǎng)BMDM的技巧：

  1.保持清潔。在切割骨頭邊緣之前，去除所有組織并用70%乙醇徹底清潔骨頭，以避免骨髓受到污染。骨頭的外部不是無(wú)菌的，這可能會(huì)污染下游培養(yǎng)物。還建議用青霉素/鏈霉素補(bǔ)充骨髓培養(yǎng)基，以進(jìn)一步降低污染風(fēng)險(xiǎn)。如果可能，請(qǐng)?jiān)跓o(wú)菌環(huán)境中進(jìn)行提取。骨頭外部的細(xì)胞最終可能會(huì)進(jìn)入骨髓提取物中并長(zhǎng)出巨噬細(xì)胞前體。

  2.制作單細(xì)胞懸浮液。使用針頭和注射器分離細(xì)胞團(tuán)塊。骨髓可能會(huì)以大細(xì)胞團(tuán)塊的形式被沖洗出來(lái)，但可以用針頭上下沖洗來(lái)分解這些細(xì)胞團(tuán)塊，以制作單細(xì)胞懸浮液。一旦去除細(xì)胞團(tuán)塊，還應(yīng)使用70uM細(xì)胞過(guò)濾器過(guò)濾細(xì)胞懸浮液以去除骨碎片。

  3.從骨髓中裂解紅細(xì)胞。這將濃縮您的樣本中的巨噬細(xì)胞前體并增加您的BMDM產(chǎn)量。

  4.細(xì)胞密度很重要。在進(jìn)行分化之前，使用傳統(tǒng)血球計(jì)數(shù)器和顯微鏡對(duì)骨髓細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)和檢查其活力。骨髓細(xì)胞非常小，自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器可能無(wú)法準(zhǔn)確計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度。骨髓細(xì)胞對(duì)其細(xì)胞密度很敏感：目標(biāo)是1x10 6個(gè)細(xì)胞/毫升。

  5.使用合適的塑料。在非組織培養(yǎng)涂層塑料（無(wú)菌細(xì)菌培養(yǎng)皿）上分化巨噬細(xì)胞。否則它們會(huì)變得過(guò)于粘附，您可能無(wú)法將它們拆下重新接種用于實(shí)驗(yàn)。

  6.堅(jiān)持嚴(yán)格的細(xì)胞喂養(yǎng)。BMDM培養(yǎng)基必須含有巨噬細(xì)胞集落刺激因子( M-CSF )–可以使用重組形式的蛋白質(zhì)(10ng/mL)或來(lái)自自然分泌該蛋白質(zhì)的鼠成纖維細(xì)胞L929的條件培養(yǎng)基(培養(yǎng)基的20%v/v)。提取后第4天，向培養(yǎng)物中添加等量的新鮮培養(yǎng)基，從而使培養(yǎng)基體積加倍。逐滴添加以免擾亂細(xì)胞。提取后第7天，巨噬細(xì)胞將分化，現(xiàn)在可以分離并重新接種用于實(shí)驗(yàn)。此后必須每48小時(shí)更新50%的培養(yǎng)基以保持細(xì)胞活力。不要完全更換培養(yǎng)基，因?yàn)樵?xì)胞對(duì)其分泌的自分泌因子很敏感。

  7.不要干擾早期培養(yǎng)。雖然在提取后的幾天內(nèi)檢查細(xì)胞可能很誘人，但在前4天內(nèi)不要觸摸培養(yǎng)皿，以讓細(xì)胞附著。

8. 時(shí)機(jī)很重要。BMDM將在提取后7天分化。實(shí)驗(yàn)（包括巨噬細(xì)胞極化（如果需要））應(yīng)從此時(shí)開(kāi)始，持續(xù)時(shí)間不超過(guò)一周。此后，細(xì)胞可能不再代表巨噬細(xì)胞表型和基因型。

上述通蔚為大家介紹了如何培養(yǎng)骨髓巨噬細(xì)胞及成功提取和培養(yǎng)BMDM的技巧。希望上述內(nèi)容對(duì)您培養(yǎng)巨噬細(xì)胞有所幫助。