上篇給大家講過(guò)《常見(jiàn)細(xì)胞基培養(yǎng)有哪些種類(lèi)》，細(xì)胞培養(yǎng)基是細(xì)胞不可缺少的部分。今天圍繞細(xì)胞培養(yǎng)，小蔚給結(jié)合自己多年的經(jīng)驗(yàn)給大家講講細(xì)胞培養(yǎng)的步驟。讓各位科研小伙伴在實(shí)驗(yàn)室也能順利實(shí)驗(yàn)。

  細(xì)胞培養(yǎng)的步驟

  第一步：需要將超凈臺(tái)及所用儀器耗材進(jìn)行紫外線滅菌，時(shí)間為30分鐘。然后我們打開(kāi)水浴鍋預(yù)熱至37度。將培養(yǎng)基放入37度的培養(yǎng)箱或水浴鍋預(yù)熱。

  第二步：從夜氮罐中取出凍存細(xì)胞，然后將凍存細(xì)胞放置-80度的冰箱等5-10分鐘。將細(xì)胞至于冰箱讓管內(nèi)液氮蒸發(fā)后再進(jìn)行水浴可以避免水浴過(guò)程中發(fā)生安全事故。

  第三步：用37度水浴快速融化細(xì)胞，待凍存細(xì)胞融化至僅有米粒大小冰塊時(shí)停止水浴，融化時(shí)間通常在1分鐘左右。這里建議將凍存的細(xì)胞裝在透明的PE手套中進(jìn)行水浴，這樣可以有效避免水浴帶來(lái)的污染。

  第四步：將凍存管在150g條件下離心1-2min，注意參數(shù)約為90-1000rpm，不同離心機(jī)可能有差異，需提前設(shè)置好。

  第五步：打開(kāi)超凈臺(tái)取出預(yù)熱好的培養(yǎng)基，然后用酒精噴灑消毒后放入超靜臺(tái)內(nèi)，隨后在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加10毫升培養(yǎng)基。

  第六步：離心完成后取出凍存的細(xì)胞，用酒精擦拭消毒后小心開(kāi)啟凍存管，棄上清，取細(xì)胞沉淀重懸后接種至培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，注意重懸吹打細(xì)胞力度不要過(guò)大，用十字法或八字法混勻細(xì)胞。

  第七步：鏡檢確認(rèn)細(xì)胞均勻分布在培養(yǎng)基后將細(xì)胞放置培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

  細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)

  1、細(xì)胞培養(yǎng)要遵循安全標(biāo)準(zhǔn)以在實(shí)驗(yàn)室中保護(hù)自己。需要個(gè)人防護(hù)裝備（實(shí)驗(yàn)室外套、實(shí)驗(yàn)室手套、安全眼鏡）。特別是，在處理液氮時(shí)，請(qǐng)務(wù)必遵守各實(shí)驗(yàn)室制定的規(guī)定，例如使用特殊的絕緣手套、全臉面罩、防濺圍裙和手套。另外，為了防止頭發(fā)污染，最好將長(zhǎng)發(fā)扎起來(lái)或戴上帽子。

  為避免空氣傳播細(xì)菌，請(qǐng)將正常實(shí)驗(yàn)和組織培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)服和鞋分開(kāi)，并避免污染培養(yǎng)室環(huán)境。通過(guò)穿著不同顏色的夾克或?qū)嶒?yàn)室外套更容易區(qū)分它們。

  2、實(shí)驗(yàn)環(huán)境的準(zhǔn)備。始終保持超凈工作臺(tái)、工作臺(tái)以及其他處理細(xì)胞的區(qū)域周?chē)鷧^(qū)域的清潔。避免將紙板等包裝物放置在進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的區(qū)域。請(qǐng)務(wù)必定期檢查和清潔培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、離心機(jī)、顯微鏡等，保持清潔。定期使用SigmaClean®清潔水浴。

  所有使用的材料，如試劑、燒瓶和培養(yǎng)基，都應(yīng)貼上標(biāo)簽或標(biāo)明日期和內(nèi)容，以明確里面的內(nèi)容。另外，使用前請(qǐng)務(wù)必檢查所用培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量。每天檢查培養(yǎng)基是否有細(xì)菌或真菌污染的跡象。即使您購(gòu)買(mǎi)了市售的培養(yǎng)基，也請(qǐng)務(wù)必進(jìn)行此項(xiàng)檢查。

  所有與細(xì)胞直接接觸的培養(yǎng)箱、培養(yǎng)設(shè)備、培養(yǎng)基等必須無(wú)菌，防止微生物污染。因此，所有使用過(guò)的物品都必須進(jìn)行滅菌或消毒。

  一般用于消毒的酒精有效濃度為乙醇70%左右，異丙醇60-70%左右，通過(guò)脫水凝固進(jìn)行消毒。乙醇對(duì)大多數(shù)病毒有效（不適用于沒(méi)有外殼的病毒），異丙醇對(duì)病毒無(wú)效。

  滅菌主要有三種：高壓滅菌、干熱滅菌和過(guò)濾滅菌。

  3、在實(shí)際操作過(guò)程中，還有一些需要注意的地方。嘗試一次僅使用一種類(lèi)型的細(xì)胞系。這降低了交叉污染和錯(cuò)誤標(biāo)簽的風(fēng)險(xiǎn)。此外，如果超凈工作臺(tái)中發(fā)生細(xì)菌或支原體的氣溶膠傳播，受影響的瓶子和燒瓶也會(huì)減少。

  在操作之間使用合適的消毒劑（例如 70% 乙醇）對(duì)工作表面進(jìn)行消毒，并在處理不同細(xì)胞系之間等待至少 15 分鐘。培養(yǎng)過(guò)程中，每個(gè)細(xì)胞系的培養(yǎng)基瓶盡可能遠(yuǎn)離。應(yīng)定期檢測(cè)細(xì)胞是否有支原體感染。

  上述為大家介紹細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程步驟及注意事項(xiàng)，希望上述文章對(duì)大家有所幫助。如果您對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程還有疑問(wèn)，可以和我們溝通。上海通蔚可以產(chǎn)品有細(xì)胞，如果想了解了解細(xì)胞系，歡迎前來(lái)咨詢(xún)。