在生物實(shí)驗(yàn)中，使用二抗通過(guò)與一抗結(jié)合，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)抗原的間接檢測(cè)。二抗通常是帶有標(biāo)簽，以方面檢測(cè)和純化。在實(shí)驗(yàn)中，選擇合適的二抗提供高信號(hào)、低背景和對(duì)您的科學(xué)問(wèn)題的清晰洞察。下文將為您詳細(xì)介紹一下二抗的選擇技巧。

  二抗選擇

  在實(shí)驗(yàn)中選擇合適的二抗取決于多種因素，以確保高度靈敏和準(zhǔn)確檢測(cè)目標(biāo)抗原。這些因素包括靶標(biāo)特異性、克隆性、宿主物種、抗體形式、結(jié)合物類型和交叉吸附抗體等等。接下來(lái)我們一一為您介紹。

  1.靶標(biāo)特異性

  二抗必須針對(duì)一抗的宿主物種產(chǎn)生。例如，如果一抗是在小鼠中產(chǎn)生的，則二抗必須是抗小鼠的，并且在小鼠以外的宿主物種中產(chǎn)生（例如，山羊抗小鼠二抗）。此外，二抗應(yīng)該對(duì)一抗類或亞類具有特異性。由于大多數(shù)多克隆一抗是針對(duì)同種型IgG產(chǎn)生的，因此使用的二抗應(yīng)該識(shí)別IgG重鏈和輕鏈（抗IgGH+L）。另一方面，單克隆一抗是針對(duì)特定IgG亞類產(chǎn)生的，因此需要亞類特異性二抗來(lái)檢測(cè)它們。

  2.克隆性

  傳統(tǒng)上，抗體被分為多克隆抗體和單克隆抗體。多克隆二抗是識(shí)別同一抗原上不同表位的異質(zhì)抗體群，而單克隆二抗是識(shí)別抗原上相同表位的同質(zhì)抗體群。在決定抗體克隆性時(shí)，選擇取決于預(yù)期應(yīng)用的更重要因素——特異性或靈敏度。雖然單克隆二抗比多克隆抗體具有更好的特異性，并且是需要高度特異性靶標(biāo)檢測(cè)的應(yīng)用的首選（例如，用于檢測(cè)特定的小鼠同種型），但多克隆二抗比單克隆二抗靈敏得多，因此用于需要高靈敏度的應(yīng)用（例如，用于檢測(cè)低豐度靶標(biāo)）。

  3.宿主物種

  宿主物種是指生產(chǎn)二抗的動(dòng)物。確保二抗宿主與生產(chǎn)一抗的宿主動(dòng)物不同非常重要。雖然大多數(shù)一抗是在兔子或老鼠體內(nèi)生產(chǎn)的，但山羊是市售二抗最廣泛使用的宿主動(dòng)物。

  在進(jìn)行多重實(shí)驗(yàn)時(shí)，雖然建議所有一抗均來(lái)自同一宿主物種，但使用的二抗應(yīng)在同一宿主物種中產(chǎn)生。這有助于防 止二抗與非目標(biāo)物種的一抗之間發(fā)生交叉反應(yīng)。

  4.抗體形式

  二抗有多種形式，包括完整抗體和抗體片段。二抗形式的選擇取決于抗體的預(yù)期應(yīng)用。例如，對(duì)于組織樣本中的IHC和IF，包括F(ab')2和Fab'的抗體片段比完整抗體更受歡迎，因?yàn)樗鼈兊某叽绺。梢愿玫卮┩附M織。此外，由于片段二抗缺乏Fc區(qū)，它們有助于消除Fc區(qū)與某些細(xì)胞類型（B細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞）上的Fc受體非特異性結(jié)合導(dǎo)致的高背景，從而使它們非常適合用于富含Fc受體的樣本。然而，需要記住的一點(diǎn)是，片段抗體的靈敏度低于完整抗體，因?yàn)樗鼈兊某叽巛^小，可以結(jié)合更少的染料或酶分子。

  5.結(jié)合物類型

  二抗結(jié)合物的選擇主要取決于兩個(gè)因素：二抗的應(yīng)用，以及該應(yīng)用中使用的檢測(cè)方法。例如，在進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)時(shí)，雖然HRP標(biāo)記的二抗用于化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，但建議使用熒光染料標(biāo)記的二抗進(jìn)行熒光檢測(cè)。下表根據(jù)預(yù)期應(yīng)用和檢測(cè)方法重點(diǎn)介紹了建議的二抗結(jié)合物。

  6.交叉吸附抗體

  交叉吸附二抗是傳統(tǒng)的多克隆二抗，經(jīng)過(guò)額外的純化步驟以消除與非目標(biāo)物種的非預(yù)期IgG的交叉反應(yīng)。當(dāng)二抗與樣品中的內(nèi)源性免疫球蛋白結(jié)合或在多路復(fù)用應(yīng)用中與脫靶抗體結(jié)合時(shí)，交叉反應(yīng)可能導(dǎo)致高背景或非特異性信號(hào)。交叉吸附通過(guò)將親和純化的多克隆二抗通過(guò)含有固定化抗體或其他物種血清蛋白的柱子來(lái)幫助提高抗體特異性。這有助于捕獲柱子中的非特異性抗體，同時(shí)允許在流過(guò)液中收集沒(méi)有交叉反應(yīng)的抗體。

  最后，上述是通蔚為各位盤點(diǎn)選擇二抗的一些技巧，希望對(duì)大家在實(shí)驗(yàn)中選擇合適的二抗，提高實(shí)驗(yàn)的特異性。