ELISA，一種酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法，是一種基于分析板的生化免疫測(cè)定法。它廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)和生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室，用于生物分子的定量，例如蛋白質(zhì)、抗體、肽、糖蛋白和激素。

 

  該技術(shù)利用抗原和抗體之間的相互作用來產(chǎn)生可測(cè)量的結(jié)果。抗原是一種啟動(dòng)免疫反應(yīng)的外來蛋白質(zhì)，其中可能包括與抗體復(fù)合后的一系列反應(yīng)。抗體是生物體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。ELISA測(cè)定中涉及的兩種抗體是一抗和二抗。關(guān)于抗原和抗體可以參考《免疫學(xué)檢測(cè)：一抗和二抗簡(jiǎn)介》

 

  在該技術(shù)中，抗原被固定在ELISA板的表面，然后與酶綴合物抗原特異性抗體一起孵育。這導(dǎo)致抗原-抗體復(fù)合物的形成。然后使用特定底物和合適的檢測(cè)方法，通過孵育含有抗原-抗體復(fù)合物的ELISA板來檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物。

 

  在實(shí)驗(yàn)室遵循的通用ELISA方案包括以下步驟：

 

  1、抗原固定在ELISA板的表面。

 

  2、使用封閉緩沖液覆蓋板的其余部分。

 

  3、ELISA板與抗原在室溫下孵育抗原特異性抗體。

 

  4、使用讀板器測(cè)量反應(yīng)產(chǎn)物或獲得的信號(hào)。

 

  ELISA的最后一步是將含有反應(yīng)混合物的ELISA板與合適的底物一起孵育。底物的使用取決于您使用的檢測(cè)方法，并與抗體酶聯(lián)，例如辣根過氧化物酶(HRP)、β-半乳糖苷酶和堿性磷酸酶(AP)。這有助于信號(hào)放大和板中發(fā)生的反應(yīng)的可視化。

 

  ELISA應(yīng)用中常用的一些底物是過氧化氫、魯米諾和對(duì)硝基苯磷酸鹽（pNPP底物）。

 

  在本文中，上海通蔚生物將介紹這些底物在ELISA測(cè)定過程中的工作原理、它們的功能以及它們?cè)诓煌t(yī)療和生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室和行業(yè)中的應(yīng)用。

 

  ELISA底物如何工作？

 

  ELISA底物通過與綴合的酶結(jié)合來檢測(cè)測(cè)定中使用的抗體。該酶將底物轉(zhuǎn)化為有色產(chǎn)物或熒光或電化學(xué)信號(hào)，使用分光光度計(jì)、分光熒光計(jì)或電化學(xué)裝置獲取其吸光度或讀數(shù)，以定量給定樣品中的抗原。

 

  不同的底物在與酶的氧化反應(yīng)過程中產(chǎn)生不同的顏色。例如，辣根過氧化物酶底物與HRP酶反應(yīng)后產(chǎn)生以下結(jié)果：

 

  1、ABTS（2,2′-Azinobis[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]-二銨鹽）：綠色

 

  2、TMB（3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺）：橙色

 

  3、OPD（鄰苯二胺）：藍(lán)色

 

  產(chǎn)生的顏色量或獲得的信號(hào)量與與固定在96孔板表面的抗原結(jié)合的一抗的量成正比。

 

  圖：HRP酶與其底物之間抗原抗體復(fù)合物形成和氧化反應(yīng)的圖示

 

  獲得高質(zhì)量、一致、可靠的蛋白質(zhì)測(cè)量結(jié)果。如今，研究人員使用ELISA試劑盒。這些檢測(cè)試劑盒配備了運(yùn)行特定ELISA檢測(cè)所需的所有合適試劑。它們執(zhí)行起來既簡(jiǎn)單又快捷。此外，它們具有最低的測(cè)定間和測(cè)定內(nèi)變異性、高靈敏度和最高可能的批次間一致性。

 

  市場(chǎng)上還有一些底物試劑盒，配有適合ELISA檢測(cè)步驟的酶-底物試劑配方。它們使這個(gè)過程更快更容易。

 

  ELISA底物類型

 

  根據(jù)所使用的檢測(cè)方法，ELISA底物分為以下幾類：

 

  化學(xué)發(fā)光底物

 

  報(bào)告酶-底物反應(yīng)中產(chǎn)生的光用作化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)的信號(hào)。用于HRP酶的化學(xué)發(fā)光底物溶液包括魯米諾。AP酶需要基于1,2-二氧雜環(huán)丁烷的試劑來產(chǎn)生X射線膠片或電荷耦合器件(CCD)相機(jī)捕獲的信號(hào)。

 

  為了提高化學(xué)發(fā)光信號(hào)的強(qiáng)度、持續(xù)時(shí)間和靈敏度，檢測(cè)過程中還使用了增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光底物(ECL)。然而，應(yīng)稀釋底物以防止錯(cuò)誤的高強(qiáng)度信號(hào)。

 

  顯色底物

 

  這些底物與報(bào)告酶反應(yīng)產(chǎn)生有色的不溶性反應(yīng)產(chǎn)物，并使用分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)。該方法中使用的HRP底物包括2'-嗪雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)；5-氨基水楊酸（5-AS）；3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)；和鄰苯二胺（OPD）。

 

  AP酶的底物是5-溴-4-氯吲哚基磷酸鹽(BCIP)和硝基藍(lán)四唑(NBT)。通過使用終止溶液可以增強(qiáng)所得的比色信號(hào)，以獲得更準(zhǔn)確的信號(hào)測(cè)量。

 

  圖：顯色檢測(cè)方法的機(jī)制說明

 

  熒光底物

 

  熒光ELISA底物需要熒光計(jì)能夠產(chǎn)生正確的激發(fā)光束，以便熒光標(biāo)簽發(fā)出信號(hào)。熒光計(jì)通過其激發(fā)和發(fā)射濾光片測(cè)量信號(hào)。

 

  ELISA測(cè)定中使用的熒光AP底物是4-MUP（4-甲基傘形磷酸酯），它在440 nm的發(fā)射波長(zhǎng)和360 nm的激發(fā)波長(zhǎng)處產(chǎn)生信號(hào)。HPPA（3-對(duì)羥基苯基丙酸）和HPA（羥基苯基乙酸）底物與過氧化物酶配對(duì)。

 

  圖：熒光檢測(cè)機(jī)制的圖示。

 

  為您的ELISA測(cè)定選擇合適的底物取決于靈敏度（較低或較高的檢測(cè)限）、時(shí)間要求以及過程中需要/使用的檢測(cè)設(shè)備的類型。

 

  ELISA底物有何用途？

 

  ELISA底物對(duì)于ELISA測(cè)定中獲得的信號(hào)的檢測(cè)、放大和定量至關(guān)重要。它們與酶發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生有色產(chǎn)物或信號(hào)，并使用合適的設(shè)備進(jìn)行測(cè)量。

 

  ELISA檢測(cè)

 

  ELISA是一種用于識(shí)別和定量生物分子（例如蛋白質(zhì)、肽、糖蛋白和激素）的生化測(cè)定法。ELISA的最后一步是對(duì)含有抗原抗體（與熒光團(tuán)或酶結(jié)合）復(fù)合物的反應(yīng)混合物以及用于反應(yīng)可視化的合適底物進(jìn)行孵育的ELISA板。

 

  底物與HRP或AP酶反應(yīng)，產(chǎn)生不溶性有色反應(yīng)產(chǎn)物或信號(hào)，由儀器、分光光度計(jì)或分光熒光計(jì)進(jìn)行測(cè)量。

 

  哪些行業(yè)使用ELISA底物？

 

  HRP和AP是兩種最常用的酶，用于在ELISA檢測(cè)中結(jié)合抗體來檢測(cè)抗原。這主要是因?yàn)樗鼈兊暮?jiǎn)單性和高靈敏度。

 

  在測(cè)定中，它們與合適的底物發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生用于抗原分析的可測(cè)量信號(hào)。因此，ELISA底物是ELISA方案的關(guān)鍵組成部分之一，并用于許多不同的實(shí)驗(yàn)室和行業(yè)。

 

  制藥

 

  制藥行業(yè)使用ELISA測(cè)試來檢測(cè)多種疾病，例如流感、艾滋病毒、登革熱和萊姆病。市場(chǎng)上還有一些ELISA試劑盒，可以使工作流程更快、更輕松。

 

  此外，ELISA測(cè)定在疫苗開發(fā)中也至關(guān)重要。它們檢測(cè)針對(duì)故意注射到宿主體內(nèi)的抗原而形成的抗體。

 

  食品工業(yè)

 

  在食品工業(yè)中，ELISA檢測(cè)用于檢測(cè)制成品中的食品過敏原，特別是涉及牛奶、杏仁、花生、核桃和雞蛋。它可以防止食品中的欺詐性替代品并證明其在市場(chǎng)上的真實(shí)性。