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ELISA是用來檢測什么的?ELISA檢測原理及實踐應(yīng)用指南

發(fā)布時間:2024-03-12     發(fā)布作者:通蔚生物

  在生命科學領(lǐng)域的許多情況下,及時且經(jīng)濟高效地檢測和定量樣品中的抗原或抗體非常重要。從識別接種疫苗或感染個

體的免疫反應(yīng),檢測您希望在細胞表面表達的蛋白質(zhì)的表達,到執(zhí)行質(zhì)量控制測試。擁有能夠進行此類評估的工具是關(guān)鍵。


elisa試劑盒

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  酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)就是這樣一種測試,已被證明作為研究和診斷工具具有無價的價值。作為科研人員,了解認識ELISA檢測方法,不僅有助于他們更好地進行實驗研究,更能為他們的科研成果提供有力支撐。


  ELISA檢測原理


  ELISA基于抗原抗體反應(yīng)的概念,代表白細胞B細胞產(chǎn)生的抗體與抗原之間的化學相互作用。這種特定的免疫反應(yīng)在保護身體免受病原體和毒素等入侵者的侵害方面發(fā)揮著重要作用。因此,通過利用這種反應(yīng),ELISA可以對抗原進行高度靈敏和選擇性的定量/定性分析,包括蛋白質(zhì)、肽、核酸、激素、除草劑和植物次生代謝物。為了檢測這些分子,使用酶標記抗原或抗體,即所謂的酶免疫測定,其中堿性磷酸酶(ALP)、辣根過氧化物酶(HRP)和β-半乳糖苷酶都常用。液相中的抗原被固定在固相上,例如由硬質(zhì)聚苯乙烯、聚氯乙烯和聚丙烯構(gòu)成的微量滴定板。隨后,使抗原與特異性抗體反應(yīng),并通過酶標記的二抗進行檢測。使用顯色底物產(chǎn)生的顏色對應(yīng)于抗原的存在。例如,ALP水解磷酸對硝基苯酯產(chǎn)生對硝基苯酚,可在405 nm(黃色)處檢測到,而HRP催化顯色底物的轉(zhuǎn)化,例如2,2'-連氮基-雙(3-乙基苯并噻唑啉)-6-磺酸)二銨鹽、3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺、鄰苯二胺生成有色產(chǎn)品。通過使用化學發(fā)光底物(例如分別用于ALP和HRP的氯-5-取代金剛烷基-1,2-二氧雜環(huán)丁烷磷酸鹽和魯米諾)以及用于β-半乳糖苷酶的熒光底物(例如4-甲基傘形基半乳糖苷和硝基苯基半乳糖苷),可以實現(xiàn)更靈敏的檢測取得成就。這些酶-底物反應(yīng)通常在30-60分鐘內(nèi)完成,對于各個反應(yīng),通過添加適當?shù)娜芤海ɡ鐨溲趸c、鹽酸、硫酸、碳酸鈉和疊氮化鈉)來停止反應(yīng)。最后,使用微量滴定板讀數(shù)器檢測有色或熒光產(chǎn)物。


  ELISA檢測步驟


  ELISA有多種常用方法類型。但它們都利用在96孔聚苯乙烯板底部堆積的抗體和抗原。這些孔經(jīng)過化學處理,使其具有“粘性”,從而增加了蛋白質(zhì)吸附到板表面的能力。

elisa檢測四大類型

  ELISA測定依賴于酶結(jié)合標記和底物之間的酶促反應(yīng)來產(chǎn)生比色、化學發(fā)光或熒光產(chǎn)物。然后通過分光光度計或熒光計檢測和定量這些產(chǎn)物,提供有關(guān)樣品中目標蛋白濃度的信息。


  ELISA由多個步驟組成。其中許多步驟是封閉和洗滌步驟,以防止非特異性結(jié)合。當?shù)鞍踪|(zhì)通過脫靶相互作用相互吸附或吸附到ELISA板的塑料表面時,就會發(fā)生非特異性結(jié)合。不同方法之間的確切ELISA步驟略有不同,但這里我們將重點關(guān)注夾心ELISA作為示例。


  夾心ELISA步驟


  第1步:捕獲蛋白的固定化


  在夾心ELISA中,捕獲蛋白是抗體,目標是抗原。因此,ELISA的第一個步驟是將捕獲抗體固定到板上。許多ELISA試劑盒都帶有預先固定的捕獲蛋白。


  第2步:洗掉孔表面任何未吸附的捕獲蛋白


  使用去污劑的洗滌步驟可減少蛋白質(zhì)之間的脫靶疏水相互作用,并從板上去除未結(jié)合的捕獲蛋白質(zhì)。


  第3步:封閉板上任何未結(jié)合的位點


  蛋白質(zhì)之間的疏水相互作用是由電荷或疏水性介導的。這意味著可以通過封閉和清洗步驟在一定程度上減輕它們。


  將蛋白質(zhì)添加到板中,蛋白質(zhì)吸附到板表面的開放位點。牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白或抑肽酶等蛋白質(zhì)通常用于ELISA測定中的封閉。


  這些蛋白質(zhì)將吸附到板上,從而防止目標蛋白質(zhì)隨后訪問這些位點。以這種方式降低非特異性結(jié)合的發(fā)生率會導致背景噪音降低。


  第4步:洗掉孔中所有未吸附的封閉蛋白


  第二個洗滌步驟去除任何未結(jié)合的封閉蛋白。


  第5步:與樣品(血清、尿液、唾液或加標研究溶液)一起孵育


  在這一步中,抗體和抗原之間發(fā)生特異性識別。在夾心ELISA中,抗體被吸附到板上,并與樣品液中的目標抗原結(jié)合。這需要一個孵育步驟以使結(jié)合動力學達到平衡。


  第6步:洗掉孵化液


  這是至關(guān)重要的洗滌步驟,通常需要多次洗滌以確保洗掉任何未結(jié)合的抗原。在此步驟之后,孔中唯一應(yīng)保留的抗原是那些附著于捕獲抗體的抗原。


  第7步:與檢測抗體一起孵育


  ELISA中的檢測抗體與某種標記物結(jié)合,例如熒光團(用于熒光測定)或酶(用于比色檢測或化學發(fā)光)。檢測抗體“識別”目標抗原上與捕獲抗體不同的表位。因此,三明治ELISA測定產(chǎn)生捕獲抗體-抗原-檢測抗體的“三明治”。


  第8步:洗掉未結(jié)合的檢測抗體


  步驟9:應(yīng)用底物進行化學比色或化學發(fā)光反應(yīng),或應(yīng)用入射光進行熒光反應(yīng),并對信號進行定量


  根據(jù)所使用的ELISA方法,熒光量、發(fā)光量或顏色強度表明從樣品中捕獲了多少目標抗原。

elisa步驟


  ELISA與其他檢測方法的區(qū)別


在生命科學領(lǐng)域,科研人員經(jīng)常需要運用各種檢測方法對生物樣本進行定性和定量分析。酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)作為其中的一種常用技術(shù),與其他檢測方法相比,既存在相似之處,也有其獨特之處。為了更直觀的表達,下面就以表格對比:


ELISA

其他免疫學檢測方法(如免疫熒光、免疫組化)

PCR(聚合酶鏈式反應(yīng))

免疫印跡

原理

抗原-抗體特異性結(jié)合,酶促反應(yīng)放大信號

抗原-抗體特異性結(jié)合

DNA復制擴增特定序列

蛋白質(zhì)與抗體的特異性結(jié)合

操作流程

簡便、快速,高通量

相對簡便,但可能涉及熒光標記等步驟

復雜,需要精密的儀器和嚴格的實驗條件

相對復雜,涉及電泳、轉(zhuǎn)膜等步驟

檢測范圍

抗原、抗體檢測,廣泛適用于多個領(lǐng)域

抗原、抗體檢測,多用于組織或細胞定位

DNA、RNA特定序列檢測

蛋白質(zhì)表達分析

靈敏度和特異性

高靈敏度和特異性

高靈敏度和特異性

極高靈敏度和特異性

高靈敏度和特異性

樣本要求

對樣本純度要求較高

對樣本純度有一定要求

DNA/RNA質(zhì)量要求較高

對蛋白質(zhì)樣本質(zhì)量有一定要求

結(jié)果解讀

需要謹慎,避免干擾因素影響

需要根據(jù)熒光信號等判斷

需要通過凝膠電泳和序列分析

通過條帶位置和強度分析蛋白質(zhì)表達

適用場景

疾病診斷、藥物研發(fā)、環(huán)境監(jiān)測等

組織學、病理學等研究

基因檢測、疾病診斷、分子生物學研究

蛋白質(zhì)表達分析、信號通路研究


  請注意,這個表格只是對ELISA和其他幾種常見檢測方法的一個簡要對比,實際上每種檢測方法都有其獨特的特點和適用場景。科研人員在實際應(yīng)用中,需要根據(jù)具體的研究需求和實驗條件來選擇最合適的檢測方法。


  ELISA檢測應(yīng)用


  ELISA可用來定量一份檢測樣品中的一種或多種抗原。鑒于抗體試劑的特異性以及檢測的簡易性,ELISA通常被視為生物樣品定量檢測的金標準。在生物醫(yī)學/生物化學領(lǐng)域,使用抗體-抗原結(jié)合連同信號放大的ELISA原理的檢測非常普遍。在研究實驗室,這些檢測可用來定量蛋白水平或通路激活。在臨床上,ELISA有各種用途,包括測定患者血清樣品中藥物治療的生物標記物或細胞因子水平。ELISA還適用于植物生物學,并且可用于檢測農(nóng)作物過敏原。


  將ELISA用作一種研究工具


  在多種研究領(lǐng)域都會用到ELISA平臺。它能特異并靈敏地檢測抗體,因此是一種方便的生物發(fā)現(xiàn)工具。它在所有生物研究領(lǐng)域中被廣泛用來檢測和定量目的抗原。這類抗原會被分泌成細胞培養(yǎng)基、某種細胞中的總蛋白,或細胞信號轉(zhuǎn)導期間發(fā)生的翻譯后修飾(PTM)


  將ELISA用作一種診斷工具


  除了用于研究之外,ELISA還廣泛用于診斷檢測,包括對病毒感染、食物過敏原、毒性和癌癥的診斷檢測。用抗體檢測感染性病毒是一種快速的臨床檢測,這種檢測在擴展后可同時檢測多份樣品。這些檢測通常在血清或血樣上完成,但也可以使用細胞或組織的裂解物進行。


  ELISA檢測的發(fā)展趨勢


  隨著生命科學技術(shù)的不斷進步和科研需求的日益增長,酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)作為一種經(jīng)典且廣泛應(yīng)用的檢測技術(shù),其發(fā)展趨勢也備受關(guān)注。未來,ELISA檢測將在以下幾個方面展現(xiàn)出明顯的發(fā)展趨勢:


  一、自動化和智能化將成為ELISA檢測的重要發(fā)展方向。傳統(tǒng)的ELISA實驗操作過程雖然相對簡便,但仍存在繁瑣的樣本處理、試劑添加和結(jié)果判讀等步驟。隨著自動化儀器和人工智能技術(shù)的不斷發(fā)展,未來的ELISA檢測將實現(xiàn)更高程度的自動化和智能化,從樣本處理到結(jié)果分析,整個過程將更加快速、準確和便捷。


  二、高靈敏度和高特異性將是ELISA檢測追求的另一個重要目標。隨著科研人員對疾病發(fā)病機制、藥物作用機制等問題的深入研究,對檢測技術(shù)的靈敏度和特異性要求也越來越高。未來,通過優(yōu)化抗體選擇、改進實驗條件、引入新的信號放大技術(shù)等手段,ELISA檢測的靈敏度和特異性將得到進一步提升,為科研人員提供更加準確、可靠的數(shù)據(jù)支持。


  三、多重檢測和微型化也是ELISA檢測未來的發(fā)展趨勢之一。多重檢測能夠同時檢測多種抗原或抗體,提高檢測效率和通量;而微型化則能夠減少樣本和試劑的用量,降低成本,同時便于現(xiàn)場快速檢測。這些技術(shù)的發(fā)展將使ELISA檢測更加適應(yīng)復雜多樣的科研需求。


  四、隨著生命科學的快速發(fā)展,交叉學科的研究也越來越受到重視。未來,ELISA檢測將與其他技術(shù)如基因測序、蛋白質(zhì)組學等相結(jié)合,形成多技術(shù)融合的檢測平臺,為科研人員提供更加全面、深入的分析手段。


  ELISA是用來檢測什么?通過上述介紹,相信您對elisa檢測有所了解。ELISA在科研領(lǐng)域重要性是不言而有的,ELISA在不斷的推動生命科學的發(fā)展,作為科研人員,我們與時俱進,不斷的深入學習和掌握ELISA檢測技術(shù),推動科研進步!



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