ELISA是一種快速、靈敏、準(zhǔn)確、可靠的定量分析方法。樣品制備是ELISA實驗成功的關(guān)鍵。在開始采集ELISA樣品時,我們可能會遇到一些問題。用于ELISA的常見樣品包括血液(血清、血漿)、組織勻漿、細(xì)胞裂解液和細(xì)胞培養(yǎng)上清液等。許多因素都會影響ELISA實驗的結(jié)果,例如采樣時間、處理、保存等。現(xiàn)在為大家介紹樣品處理方法,以供參考。
血樣本
血清和血漿是血液處理中常見的兩種樣本類型。它們的主要區(qū)別在于血清在凝固后分離而得,缺乏纖維蛋白原,而血漿則在加入抗凝劑后分離得到。但由于血漿中含有纖維蛋白原,當(dāng)纖維蛋白原對檢測目標(biāo)有影響時,建議使用血清。兩者均適用于大多數(shù)ELISA實驗。
血清處理:將血樣品放入血清分離管中,讓其在室溫下凝固兩小時或在4°C下過夜。隨后,以約1,000×g的速度離心20分鐘,將血清分離出來。建議立即使用新鮮制備的血清,或?qū)⑵浞盅b并存儲在-20°C或-80°C下以備后用,但要避免反復(fù)凍融。
血漿處理:使用EDTA或肝素作為抗凝劑來收集血漿。收集后的血樣品應(yīng)在30分鐘內(nèi)在2-8°C下以1,000×g的速度離心15分鐘,將血漿分離出來。同樣,建議立即使用或分裝后存儲在-20°C或-80°C下,但要避免反復(fù)冷凍/解凍循環(huán)。
組織勻漿
組織沖洗和稱重:首先,在冰冷的PBS中徹底沖洗組織樣本,以去除多余的血液,并確保維持組織的完整性。在進(jìn)行均質(zhì)化之前,請務(wù)必稱重組織樣本,以確保后續(xù)步驟中添加適量的裂解液。
組織切碎和加入裂解液:將組織樣本切碎并置于新鮮的裂解液中。根據(jù)目標(biāo)蛋白的亞細(xì)胞位置,選擇適當(dāng)?shù)牧呀庖?。建議在每單位組織重量中添加特定比例的裂解緩沖液,以確保最佳的裂解效果。
超聲處理:使用超聲波細(xì)胞破碎儀對懸浮液進(jìn)行超聲處理,直到溶液變得清澈透明。確保超聲處理的時間和功率是一致的,以獲得均勻的懸浮液。
離心和保存:將勻漿在適當(dāng)?shù)碾x心速度下離心,以去除細(xì)胞碎片和殘留的細(xì)胞核。收集上清液,可立即進(jìn)行測定,或分裝后存儲在≤-20℃以備后用。請注意,避免反復(fù)冷凍/解凍循環(huán),以保持樣品的穩(wěn)定性和質(zhì)量。
細(xì)胞裂解物
洗滌和分離細(xì)胞:貼壁細(xì)胞首先使用冷PBS輕輕洗滌,然后使用胰蛋白酶進(jìn)行分離。對于懸浮細(xì)胞,可以直接進(jìn)行離心收集。
重復(fù)洗滌:對細(xì)胞進(jìn)行三次冷PBS清洗,以確保去除殘留的培養(yǎng)基或其他污染物。
裂解:將細(xì)胞懸浮于新鮮的裂解緩沖液中,濃度為107個細(xì)胞/mL。如果需要,可以對細(xì)胞進(jìn)行超聲波處理,直到溶液變得清澈透明。
離心去除細(xì)胞碎片:在2-8℃條件下,以1,500×g的速度離心10分鐘,以去除細(xì)胞碎片和其他雜質(zhì)。
檢測或分裝:收集上清液并立即進(jìn)行測定,或?qū)悠贩盅b存儲在≤-20℃。對于細(xì)胞培養(yǎng)上清液,以1,000×g的速度離心樣品20分鐘,收集上清液并立即測定,或?qū)悠贩盅b在-20℃或-80℃下備用。避免反復(fù)凍融,以確保樣品的穩(wěn)定性和質(zhì)量。
糞便
樣本采集:取8份100mg(約80-120mg)的糞便樣本。
樣本處理:將每份糞便樣本加入5mlPBS中,并在振蕩器中振蕩40秒,以確保樣品的均勻混合。
均質(zhì)化:將混合后的樣品在室溫下均質(zhì)化25-30分鐘,以確保充分裂解和釋放目標(biāo)分子。
離心:將均質(zhì)化后的樣品以1mL的量轉(zhuǎn)移到新的離心管中,并以10,000×g的速度離心20分鐘,以沉淀固體顆粒和雜質(zhì)。
收集上清液:立即收集離心后的上清液進(jìn)行測定,或?qū)⑵涞确植Υ嬖凇?20℃或-80℃,以備后續(xù)使用。務(wù)必避免樣品反復(fù)冷凍/解凍循環(huán),以確保樣品質(zhì)量和穩(wěn)定性。
尿液
樣品采集:將當(dāng)天的第一次尿液(中流)或者24小時尿液以無菌方式直接收集到無菌容器中。
離心:將尿液樣品以1,000×g的速度離心15分鐘,以沉淀固體顆粒和雜質(zhì)。
收集上清液:立即收集離心后的上清液進(jìn)行測定,或?qū)⑵涞确植Υ嬖?20℃或-80℃,以備后續(xù)使用。務(wù)必避免樣品反復(fù)冷凍/解凍循環(huán),以確保樣品質(zhì)量和穩(wěn)定性。
腦脊液
離心:將腦脊液樣本以1,000×g的速度離心15分鐘,以沉淀固體顆粒和雜質(zhì)。
收集上清液:立即收集離心后的上清液進(jìn)行檢測,或?qū)⑵涞确植Υ嬖?20℃或-80℃,以備后續(xù)使用。務(wù)必避免樣品反復(fù)冷凍/解凍循環(huán),以確保樣品質(zhì)量和穩(wěn)定性。
樣品處理的目的 是為了收集目標(biāo)分子,這是實驗成功的前提。由于蛋白質(zhì)一般都容易 變性和 降解,因此處理過程應(yīng)盡量溫和。樣品的保存也很重要,尤其要注意不要反復(fù)凍融,樣品可分裝保存,4℃保存時間不超過一周,-20℃保存時間不超過1個月,-80 ℃保存時間不超過2個月。測定前,將樣品恢復(fù)至室溫,嚴(yán)禁加熱樣品。