ELISA是一種快速、靈敏、準(zhǔn)確、可靠的定量分析方法。樣品制備是ELISA實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。在開始采集ELISA樣品時(shí)，我們可能會(huì)遇到一些問題。用于ELISA的常見樣品包括血液（血清、血漿）、組織勻漿、細(xì)胞裂解液和細(xì)胞培養(yǎng)上清液等。許多因素都會(huì)影響ELISA實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，例如采樣時(shí)間、處理、保存等。現(xiàn)在為大家介紹樣品處理方法，以供參考。

  血樣本

  血清和血漿是血液處理中常見的兩種樣本類型。它們的主要區(qū)別在于血清在凝固后分離而得，缺乏纖維蛋白原，而血漿則在加入抗凝劑后分離得到。但由于血漿中含有纖維蛋白原，當(dāng)纖維蛋白原對(duì)檢測(cè)目標(biāo)有影響時(shí)，建議使用血清。兩者均適用于大多數(shù)ELISA實(shí)驗(yàn)。

  血清處理：將血樣品放入血清分離管中，讓其在室溫下凝固兩小時(shí)或在4°C下過夜。隨后，以約1,000×g的速度離心20分鐘，將血清分離出來。建議立即使用新鮮制備的血清，或?qū)⑵浞盅b并存儲(chǔ)在-20°C或-80°C下以備后用，但要避免反復(fù)凍融。

  血漿處理：使用EDTA或肝素作為抗凝劑來收集血漿。收集后的血樣品應(yīng)在30分鐘內(nèi)在2-8°C下以1,000×g的速度離心15分鐘，將血漿分離出來。同樣，建議立即使用或分裝后存儲(chǔ)在-20°C或-80°C下，但要避免反復(fù)冷凍/解凍循環(huán)。

  組織勻漿

  組織沖洗和稱重：首先，在冰冷的PBS中徹底沖洗組織樣本，以去除多余的血液，并確保維持組織的完整性。在進(jìn)行均質(zhì)化之前，請(qǐng)務(wù)必稱重組織樣本，以確保后續(xù)步驟中添加適量的裂解液。

  組織切碎和加入裂解液：將組織樣本切碎并置于新鮮的裂解液中。根據(jù)目標(biāo)蛋白的亞細(xì)胞位置，選擇適當(dāng)?shù)牧呀庖骸＝ㄗh在每單位組織重量中添加特定比例的裂解緩沖液，以確保最佳的裂解效果。

  超聲處理：使用超聲波細(xì)胞破碎儀對(duì)懸浮液進(jìn)行超聲處理，直到溶液變得清澈透明。確保超聲處理的時(shí)間和功率是一致的，以獲得均勻的懸浮液。

  離心和保存：將勻漿在適當(dāng)?shù)碾x心速度下離心，以去除細(xì)胞碎片和殘留的細(xì)胞核。收集上清液，可立即進(jìn)行測(cè)定，或分裝后存儲(chǔ)在≤-20℃以備后用。請(qǐng)注意，避免反復(fù)冷凍/解凍循環(huán)，以保持樣品的穩(wěn)定性和質(zhì)量。

  細(xì)胞裂解物

  洗滌和分離細(xì)胞：貼壁細(xì)胞首先使用冷PBS輕輕洗滌，然后使用胰蛋白酶進(jìn)行分離。對(duì)于懸浮細(xì)胞，可以直接進(jìn)行離心收集。

  重復(fù)洗滌：對(duì)細(xì)胞進(jìn)行三次冷PBS清洗，以確保去除殘留的培養(yǎng)基或其他污染物。

  裂解：將細(xì)胞懸浮于新鮮的裂解緩沖液中，濃度為107個(gè)細(xì)胞/mL。如果需要，可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行超聲波處理，直到溶液變得清澈透明。

  離心去除細(xì)胞碎片：在2-8℃條件下，以1,500×g的速度離心10分鐘，以去除細(xì)胞碎片和其他雜質(zhì)。

  檢測(cè)或分裝：收集上清液并立即進(jìn)行測(cè)定，或?qū)悠贩盅b存儲(chǔ)在≤-20℃。對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)上清液，以1,000×g的速度離心樣品20分鐘，收集上清液并立即測(cè)定，或?qū)悠贩盅b在-20℃或-80℃下備用。避免反復(fù)凍融，以確保樣品的穩(wěn)定性和質(zhì)量。

  糞便

  樣本采集：取8份100mg（約80-120mg）的糞便樣本。

  樣本處理：將每份糞便樣本加入5mlPBS中，并在振蕩器中振蕩40秒，以確保樣品的均勻混合。

  均質(zhì)化：將混合后的樣品在室溫下均質(zhì)化25-30分鐘，以確保充分裂解和釋放目標(biāo)分子。

  離心：將均質(zhì)化后的樣品以1mL的量轉(zhuǎn)移到新的離心管中，并以10,000×g的速度離心20分鐘，以沉淀固體顆粒和雜質(zhì)。

  收集上清液：立即收集離心后的上清液進(jìn)行測(cè)定，或?qū)⑵涞确植?chǔ)存在≤-20℃或-80℃，以備后續(xù)使用。務(wù)必避免樣品反復(fù)冷凍/解凍循環(huán)，以確保樣品質(zhì)量和穩(wěn)定性。

  尿液

  樣品采集：將當(dāng)天的第一次尿液（中流）或者24小時(shí)尿液以無菌方式直接收集到無菌容器中。

  離心：將尿液樣品以1,000×g的速度離心15分鐘，以沉淀固體顆粒和雜質(zhì)。

  收集上清液：立即收集離心后的上清液進(jìn)行測(cè)定，或?qū)⑵涞确植?chǔ)存在-20℃或-80℃，以備后續(xù)使用。務(wù)必避免樣品反復(fù)冷凍/解凍循環(huán)，以確保樣品質(zhì)量和穩(wěn)定性。

  腦脊液

  離心：將腦脊液樣本以1,000×g的速度離心15分鐘，以沉淀固體顆粒和雜質(zhì)。

  收集上清液：立即收集離心后的上清液進(jìn)行檢測(cè)，或?qū)⑵涞确植?chǔ)存在-20℃或-80℃，以備后續(xù)使用。務(wù)必避免樣品反復(fù)冷凍/解凍循環(huán)，以確保樣品質(zhì)量和穩(wěn)定性。

  樣品處理的目的 是為了收集目標(biāo)分子，這是實(shí)驗(yàn)成功的前提。由于蛋白質(zhì)一般都容易 變性和 降解，因此處理過程應(yīng)盡量溫和。樣品的保存也很重要，尤其要注意不要反復(fù)凍融，樣品可分裝保存，4℃保存時(shí)間不超過一周，-20℃保存時(shí)間不超過1個(gè)月，-80 ℃保存時(shí)間不超過2個(gè)月。測(cè)定前，將樣品恢復(fù)至室溫，嚴(yán)禁加熱樣品。