發(fā)布時(shí)間:2024-02-21 發(fā)布作者:上海通蔚生物
什么是PCR?PCR也叫聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),是一項(xiàng)在體外迅速擴(kuò)增DNA片斷的技術(shù)。它能夠以及少量DNA為模版,在幾小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增出上百萬(wàn)份DNA拷貝。PCR可以用于表達(dá)載體的構(gòu),如基因重組,病原體檢測(cè)和基因檢測(cè)。
為了獲得龐大的拷貝量,PCR一般需要經(jīng)歷三十多輪循環(huán),在每輪循環(huán)過(guò)程中,都需要經(jīng)歷變性、復(fù)性和延伸三個(gè)步驟。每個(gè)步驟分別需要溫控、DNA母鏈、20至30個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的引物、耐高溫的DNA聚合酶以及四種脫氧核酸苷酸ATCG。
這5大要素中,首先是變性階段。當(dāng)溫度上升到90度時(shí),雙鏈DNA解聚為單鏈,溫度下降到50度左右時(shí),進(jìn)入復(fù)興階段。
我們需要使用兩種引物,通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合,此時(shí)需要大家提前留意各個(gè)單鏈以及引物的方向。
以 5' 到 3' 是DNA復(fù)制始終遵循的正方向,3' 至 5' 是DNA單鏈。與3' 至 5'的引物想結(jié)合,也稱(chēng)正向引物,反之, 5' 到 3' 是DNA單鏈與3' 至 5'引物想結(jié)合,稱(chēng)反向引物。
最后延伸開(kāi)始,溫度上升到七十二度左右時(shí),耐高溫的Taq酶,就四種脫氧核酸苷酸添加引物的 3'端。
在PCR中,引物之所以稱(chēng)之為引物,是因?yàn)樗?guī)定和引導(dǎo)了復(fù)制開(kāi)始的方向,也就是說(shuō),DNA每次的復(fù)制都必須從引物的 3'端開(kāi)始,沿著引物自身 5' 到 3'的方向進(jìn)行延伸。有趣的是引物模版中間的某個(gè)部位開(kāi)始引導(dǎo)復(fù)制,所以在第一輪結(jié)束時(shí),一對(duì)新產(chǎn)生的DNA雙鏈中,存在不同長(zhǎng)度的單鏈。至此,本輪翻譯結(jié)束。
接下來(lái)第一輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第二輪反應(yīng)的模版在經(jīng)過(guò)之前的三個(gè)步驟產(chǎn)生第二輪循環(huán)的產(chǎn)物。
同樣的,DNA依然能夠從引物的3'端開(kāi)始復(fù)制,又形成了新的不同長(zhǎng)度的單鏈。我們發(fā)現(xiàn)進(jìn)入第三輪反應(yīng)后,在前兩次正向、反向引物的夾擊復(fù)制下,第一次形成了兩隊(duì)等長(zhǎng)的短雙鏈DNA,既兩端僅帶引物序列的目的基因片段。接下來(lái),依據(jù)DNA半保留復(fù)制的原則,這樣的短雙鏈DNA呈指數(shù)擴(kuò)增。
上述是PCR擴(kuò)增原理的說(shuō)明,大家僅供參考!具體大家可以在實(shí)驗(yàn)中去理解每個(gè)步驟原理的情況。
上海通蔚生物一直致力于為廣大高校、科研院所和企事業(yè)單位提供的科研試劑和完善的技術(shù)服務(wù),滿足生物化學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)等生物科技實(shí)驗(yàn)需求。