Pcr(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))用于擴(kuò)增DNA特定片段的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)。在生命科學(xué)各個(gè)領(lǐng)域（基礎(chǔ)研究、生物技術(shù)、醫(yī)學(xué)、法醫(yī)學(xué)、診斷學(xué)等）都在廣泛應(yīng)用這些方法。常規(guī)的PCR主要是定性檢測(cè)，而實(shí)時(shí)PCR(QPCR)可以用來(lái)定量檢測(cè)。今天，本文為大家詳細(xì)介紹下QPCR原理及步驟，為您的實(shí)驗(yàn)選擇該技術(shù)有廣泛的了解。

  目錄：

  1、什么是QPCR?

  2、QPCR工作原理

  3、QPCR步驟

  4、QPCR應(yīng)用

5、QPCR常見(jiàn)問(wèn)題

  什么是QPCR?

  定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(QPCR)與PCR非常相似，在傳統(tǒng)PCR中，擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物或擴(kuò)增子在終點(diǎn)分析中檢測(cè)。在QPCR中，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，實(shí)時(shí)測(cè)量擴(kuò)增產(chǎn)物的積累，并在每次循環(huán)后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行量化。

  QPCR工作原理

  為了理解QPCR的工作原理，我們使用典型的擴(kuò)增圖來(lái)說(shuō)明qPCR分析（圖1）。在該圖中，x軸顯示PCR循環(huán)數(shù)，y軸顯示擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生的熒光，該熒光與試管中擴(kuò)增產(chǎn)物的量成正比。

圖 1. 擴(kuò)增圖（基線減去熒光與 PCR 循環(huán)數(shù)的關(guān)系）

  擴(kuò)增曲線顯示兩個(gè)階段，一個(gè)指數(shù)階段，接著是一個(gè)非指數(shù)平臺(tái)期。在指數(shù)階段，PCR產(chǎn)物的量在每個(gè)循環(huán)中大約增加一倍。然而，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)組分被消耗，最終一種或多種組分變得有限。此時(shí)，反應(yīng)減慢并進(jìn)入平臺(tái)期（圖1中的循環(huán)28-40）。

  最初，熒光仍處于背景水平，即使產(chǎn)物呈指數(shù)級(jí)積累，熒光的增加也是不可檢測(cè)的（循環(huán)1-18，圖1）。最終，足夠的擴(kuò)增產(chǎn)物積累以產(chǎn)生可檢測(cè)的熒光信號(hào)。發(fā)生這種情況的循環(huán)數(shù)稱(chēng)為定量循環(huán)或C q。由于C q值是在試劑不受限制的指數(shù)期測(cè)量的，因此可以使用實(shí)時(shí)qPCR根據(jù)描述反應(yīng)進(jìn)程的已知指數(shù)函數(shù)可靠而準(zhǔn)確地計(jì)算反應(yīng)中存在的模板的初始量。

  反應(yīng)的C q主要取決于擴(kuò)增反應(yīng)開(kāi)始時(shí)模板的量。如果反應(yīng)開(kāi)始時(shí)模板量較大，則需要相對(duì)較少的擴(kuò)增循環(huán)即可積累足夠的產(chǎn)物，從而產(chǎn)生高于背景的熒光信號(hào)。因此，反應(yīng)的C q會(huì)較低或較早。相反，如果反應(yīng)開(kāi)始時(shí)模板量較小，則需要更多擴(kuò)增循環(huán)才能使熒光信號(hào)高于背景。因此，反應(yīng)的C q會(huì)較高或較晚。這種關(guān)系構(gòu)成了QPCR定量方面的基礎(chǔ)。

  RNA分離

  樣本采集

  為了分離RNA并量化基因表達(dá)，樣本材料應(yīng)盡可能均勻。如果您的組織樣本由多種不同類(lèi)型的細(xì)胞組成，則可能難以確定目標(biāo)基因的表達(dá)模式。如果您的樣本不均勻，請(qǐng)使用多種可用于分離和隔離特定細(xì)胞類(lèi)型的方法之一，例如組織解剖、針吸活檢和激光捕獲顯微解剖。然后可以使用收集的細(xì)胞來(lái)獲取RNA樣本。

  RNA提取

  總RNA或poly(A+)RNA可用于大多數(shù)實(shí)時(shí)RT-qPCR應(yīng)用。使用RNA時(shí)，一個(gè)關(guān)鍵考慮因素是消除溶液、耗材和實(shí)驗(yàn)室器具中的RNase。您可以購(gòu)買(mǎi)即用型無(wú)RNase溶液，或者用焦碳酸二乙酯(DEPC)處理您的溶液，然后進(jìn)行高壓滅菌。實(shí)驗(yàn)室器具上的RNase也可以通過(guò)DEPC處理或在250°C下烘烤3小時(shí)來(lái)滅活。

  制備好的RNA樣本可能需要DNase處理，以防止任何污染基因組DNA的潛在擴(kuò)增，這可能導(dǎo)致對(duì)mRNA拷貝數(shù)的估計(jì)過(guò)高。然而，當(dāng)起始材料有限時(shí)，DNase處理可能不合適，因?yàn)轭~外的操作可能會(huì)導(dǎo)致RNA丟失?？梢酝ㄟ^(guò)設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)錄本特異性引物（例如，跨越或擴(kuò)增剪接點(diǎn)的引物）來(lái)阻止?jié)撛谖廴净蚪MDNA的擴(kuò)增。

  分析核酸數(shù)量和質(zhì)量

  準(zhǔn)確的核酸定量對(duì)于基因表達(dá)分析至關(guān)重要，尤其是當(dāng)使用總RNA量來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化目標(biāo)基因表達(dá)時(shí)。RNA濃度和純度通常通過(guò)測(cè)量260nm和280nm處的紫外吸光度比率來(lái)確定。

  QPCR步驟

  首先，使用PCR試劑和獨(dú)特或定制引物設(shè)置擴(kuò)增反應(yīng)。然后在QPCR儀器中運(yùn)行反應(yīng)，并使用專(zhuān)有儀器軟件分析收集的數(shù)據(jù)。

  通過(guò)在每個(gè)反應(yīng)孔中加入熒光報(bào)告分子，隨著產(chǎn)物DNA數(shù)量的增加，熒光也會(huì)增加，從而實(shí)現(xiàn)PCR產(chǎn)物的實(shí)時(shí)檢測(cè)。為此使用的熒光化學(xué)物質(zhì)包括DNA結(jié)合染料和熒光標(biāo)記的序列特異性引物或探針。配備熒光檢測(cè)模塊的專(zhuān)用熱循環(huán)儀用于在擴(kuò)增發(fā)生時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)。測(cè)得的熒光與擴(kuò)增子的總量成正比；熒光隨時(shí)間的變化用于計(jì)算每個(gè)循環(huán)中產(chǎn)生的擴(kuò)增子的數(shù)量。

  QPCR相對(duì)于PCR的主要優(yōu)勢(shì)在于，QPCR可讓您在寬動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)準(zhǔn)確且高靈敏度地確定模板DNA（擴(kuò)增目標(biāo)序列）的初始拷貝數(shù)。QPCR結(jié)果可以是定性的（序列的存在與否），也可以是定量的（拷貝數(shù)）。因此，定量QPCR也稱(chēng)為qPCR分析。相比之下，PCR充其量是半定量的。此外，無(wú)需凝膠電泳即可評(píng)估實(shí)時(shí)qPCR數(shù)據(jù)，從而縮短了工作時(shí)間并提高了通量。最后，由于實(shí)時(shí)qPCR反應(yīng)是在統(tǒng)一的閉管qPCR系統(tǒng)中運(yùn)行和評(píng)估數(shù)據(jù)的，因此減少了污染的機(jī)會(huì)，并且在qPCR分析中無(wú)需進(jìn)行擴(kuò)增后操作。

  qPCR應(yīng)用

  qPCR用于檢測(cè)和量化給定樣本中的核酸。由于其靈敏度高，分子生物學(xué)家最常使用qPCR來(lái)測(cè)量 基因表達(dá) ，以更好地了解各種疾病和其他生物途徑。使用qPCR開(kāi)發(fā)的其他應(yīng)用包括 下一代測(cè)序文庫(kù)量化、 病原體檢測(cè)、SNP檢測(cè)以及microRNA檢測(cè)和分析。

  帶有接頭序列的序列在擴(kuò)增過(guò)程中充當(dāng)模板。使用qPCR的好處是所用材料量最少，并且能夠?qū)崿F(xiàn)自動(dòng)化。這兩種特性都允許執(zhí)行更多高通量運(yùn)行。

  溫馨提示，qPCR運(yùn)行產(chǎn)生的數(shù)據(jù)很大程度上取決于您使用的染料和引物。如果您使用熒光DNA探針代替染料，您將能夠使用多重qPCR測(cè)量多個(gè)DNA目標(biāo)。

  qPCR常見(jiàn)問(wèn)題

  什么是多重qPCR

  多重qPCR允許在單個(gè)反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)DNA（例如來(lái)自不同生物體）。我們所有的qPCR檢測(cè)都包括內(nèi)部控制引物和探針組，雙鏈體也是如此。其他檢測(cè)，例如貓呼吸道綜合征qPCR檢測(cè)，可檢測(cè)兩個(gè)或更多個(gè)目標(biāo)DNA以及內(nèi)部控制。

  qPCR檢測(cè)的敏感性和特異性如何？

  qPCR靈敏度極高，特異性強(qiáng)，能夠檢測(cè)出樣本中數(shù)量極少的病原體。qPCR的靈敏度使得我們能夠通過(guò)對(duì)混合血清樣本或散裝牛奶樣本進(jìn)行單次測(cè)試來(lái)篩查牛群中的BVDV。

  哪些類(lèi)型的樣本適合通過(guò)qPCR進(jìn)行檢測(cè)？

  qPCR是一種非常通用的技術(shù)，可以應(yīng)用于多種樣本類(lèi)型中DNA或RNA的定量分析。

  什么是內(nèi)部（擴(kuò)增）控制？

  內(nèi)部（擴(kuò)增）對(duì)照(IC)是與病原體核酸同時(shí)擴(kuò)增的目標(biāo)DNA或RNA。IC可以是宿主基因，也可以是在DNA提取階段添加到每個(gè)樣本中的人工DNA/RNA分子。它表明反應(yīng)中存在可擴(kuò)增的DNA。在qPCR反應(yīng)中加入IC有助于識(shí)別與特定樣本、樣本收集、提交或?qū)嶒?yàn)室處理相關(guān)的假陰性結(jié)果。

  什么是閾值循環(huán)(ct)值？

  閾值循環(huán)(ct)值是PCR產(chǎn)物量（通過(guò)熒光測(cè)量）達(dá)到規(guī)定閾值所需的PCR循環(huán)數(shù)。因此，ct值可以衡量樣本中存在的目標(biāo)DNA量；因此，如果存在的目標(biāo)DNA量高，則更快達(dá)到閾值，從而導(dǎo)致較低的ct值。通常，結(jié)果中不包括ct值。

  上文為大家介紹QPCR及步驟，與“傳統(tǒng)”或終點(diǎn)PCR檢測(cè)相比，qPCR（也稱(chēng)為實(shí)時(shí)PCR）不僅可以提供樣本中基因序列的存在與否，還可以提供定量數(shù)據(jù)——它是高靈敏度、特異性檢測(cè)和定量分子標(biāo)記的黃金標(biāo)準(zhǔn)。本文篇幅有限，如果還有關(guān)于QPCR問(wèn)題，歡迎前來(lái)咨詢(xún)！