當科研實驗進行蛋白質免疫分析時，良好的信號檢測對于研究結果的可重復性至關重要。獲得良好免疫測定結果的一種特定方法是選擇與一抗相匹配的二抗。

  但什么是一抗和二抗呢？它們如何幫助信號檢測？在本文中，我們向您簡要介紹了免疫分析中信號檢測中常用的兩種抗體、這些抗體之間的差異，以及有關如何選擇一抗和二抗的一些有價值的提示。

  在本文中您將了解到：

•   什么是蛋白質免疫分析？

•   什么是抗體？

•   什么是一抗和二抗？

•   一抗和二抗的主要區別是什么？

•   一抗和二抗是如何產生的？

•   一抗和二抗在免疫測定中如何發揮作用？

•   二抗如何產生視覺信號？

•   二抗如何放大信號？

•   如何選擇一抗和二抗？

  什么是蛋白質免疫分析？

  免疫測定是使用抗體檢測實驗樣品中的蛋白質、測量其濃度并研究細胞或組織樣品中的蛋白質功能或定位的方法。

  雖然這里有幾種嚴重依賴抗體檢測的檢測技術，但我們將重點介紹兩個例子：酶聯免疫吸附測定 (ELISA) 和蛋白質印跡法。

  1.酶聯免疫吸附測定（ELISA）

  在 ELISA 中，抗體（稱為一抗）附著在固定在固體表面（例如板中的孔）上的目標蛋白上。二抗與該抗體-靶蛋白復合物結合，有助于檢測靶蛋白。這種類型的測定對于檢測少量的特定蛋白質非常有用。關于酶聯免疫吸附測定，可以參考認識免疫學試驗——酶聯免疫吸附測定 (ELISA)

  2.蛋白質印跡法（WB）

  另一種檢測靶蛋白的方法是蛋白質印跡法。與 ELISA 類似，目標蛋白固定在固體表面（本例中為膜）上。一抗檢測目標蛋白，添加二抗檢測目標蛋白。

  什么是抗體？

  抗體是針對入侵者（例如病毒或細菌）的免疫反應的蛋白質成分。在檢測到入侵者身上的外來物質（稱為抗原）后，免疫反應會產生針對這些抗原的抗體或免疫球蛋白以中和它們。

  抗體由四種多肽組成，具有兩條相同的輕鏈和兩條相同的重鏈。

  抗原結合片段或Fab片段是與抗原結合的輕鏈區域。而片段可結晶區或Fc片段是附著于細胞表面的抗體結構的尾部區域。

  根據重鏈區域，免疫球蛋白可分為以下幾類

  1、免疫球蛋白 G (IgG)

  免疫球蛋白 G 或 IgG 有 4 條鏈，其中兩條相同的 50 kDa γ 重鏈和 25 kDa κ 或 λ 輕鏈。IgG 是人血清中最豐富的抗體。根據血清中的豐度，IgG 分為四個亞類：IgG1、IgG2、IgG3 和 IgG4。

  2、免疫球蛋白 D (IgD)

  免疫球蛋白 D 或 IgD 具有 δ 重鏈。IgD 存在于未成熟的初始 B 細胞的表面。B 細胞是免疫細胞的一種。

  3、免疫球蛋白 E (IgE)

  免疫球蛋白 E（或 IgE）具有 ε 重鏈。IgE 與過敏反應有關。

  4、免疫球蛋白 A (IgA)

  免疫球蛋白 A 或 IgA 具有 λ 重鏈。IgA 是一種存在于分泌物中的抗體，例如唾液、眼淚、乳汁、呼吸道和腸道分泌物。

  5、免疫球蛋白 M (IgM)

  免疫球蛋白 M 或 IgM 具有 μ 重鏈。IgM 是感染后發育中的 B 細胞產生的第一種抗體。

  什么是一抗和二抗？

  許多免疫測定中通常使用的兩種類型的抗體是一抗和二抗。

  一抗：特異性結合抗原的抗體。

  二抗：與一抗結合的抗體。

  一抗和二抗都可以是單克隆或多克隆抗體。單克隆抗體和多克隆抗體可以參考：《蛋白質免疫測定：認識多克隆抗體和單克隆抗體》

  一抗和二抗的主要區別是什么？

  一抗和二抗之間的區別主要在于與抗原的結合。

  一抗直接與特定抗原結合。在這種情況下，它將是您實驗中的目標蛋白質。二抗與一抗結合，而不是與靶抗原結合。

  在抗體生產過程中，用于生產一抗的目標抗原和宿主物種與用于生產二抗的目標抗原和宿主物種不同。

  一抗和二抗是如何產生的？

  初級抗體的產生需要一種宿主物種，例如兔子、小鼠、山羊或雞。在第一個生產步驟中，宿主將針對抗原進行免疫以產生一抗。

  二抗的生產始于將來自一個特定宿主物種的一抗注射到完全不同的宿主物種中。例如，如果產生的抗體來自小鼠，則可以在兔、山羊或雞中產生二抗。

  針對整個抗體或 IgG 產生的二抗可識別所有 IgG 片段。它們識別輕鏈和重鏈。它們也相對便宜并且對于許多一般免疫測定有用。

  然而，它們可以結合一抗的 Fc 區和細胞上的 Fc 受體。為了提高檢測中二抗的特異性并減少交叉反應性，您可以使用針對 Fc 片段、Fab 片段或其他片段生成的特定抗體。

  例如，針對 Fab 區的二抗可用于免疫沉淀后的蛋白質印跡。這種類型的抗體僅識別 Fab 片段，因此它們比針對整個 IgG 的抗體更具特異性。因此，使用 Fab 片段特異性抗體可以避免在印跡上檢測到大小為 50 kDa 的不需要的重鏈，從而妨礙了具有相似大小的目標蛋白的可視化。

  為了檢測靶蛋白，將產生信號的分子附著到一抗或二抗上是必不可少的。

  一抗和二抗在免疫測定中如何發揮作用？

  您可以使用直接或間接免疫測定來可視化抗原與一抗的結合。

  在直接免疫測定中，一抗附著在信號分子上。當一抗與抗原結合時，這種抗原-抗體相互作用會激活信號分子，從而進行檢測。

  在間接免疫測定中，二抗有助于檢測，因為這些抗體與信號分子連接。該方法的工作原理是：二抗識別與抗原結合的一抗，然后該復合物的形成激活信號分子。

  二抗如何產生視覺信號？

  使用二抗時，您將進行間接免疫測定。此處，二抗與抗原結合的一抗結合。這種相互作用導致附著在二抗上的信號分子發出信號，或將不可檢測的底物轉化為蛋白質印跡上的視覺信號（Yu et al., 2015）。

  以下是信號分子的一些示例：

  放射性同位素

  可用于間接檢測的方法是使用放射性同位素標記的二抗，例如 Iodine-125。這種放射性同位素發射帶有低能光子的伽馬射線，可以使用 X 射線膠片檢測到。

  酶

  在蛋白質印跡中，通常使用與酶（例如辣根過氧化物）綴合的二抗。添加辣根過氧化物底物后，酶裂解無色底物并在印跡上產生可見的彩色信號。

  熒光染料

  二抗可以用熒光染料標記，例如異硫氰酸熒光素 (FITC)、R-藻紅蛋白、羅丹明和德克薩斯紅。抗體的結合會激發特定波長的熒光，并發出另一波長的光。

  二抗如何放大信號？

  在間接免疫測定中，多個帶有信號分子的二抗可以與一抗分子結合。在這種情況下，使用與信號分子結合的二抗可能會導致信號放大（Yu et al ., 2015）。因此，間接檢測比直接免疫測定靈敏得多。

  如何選擇一抗和二抗

  了解一抗的詳細信息。例如：驗證、產生抗體的宿主物種、與免疫測定的兼容性、靈敏度、成本以及對目標蛋白的特異性。

  選擇與收集樣品的宿主物種不同的一抗宿主物種。

  確保產生二抗的宿主物種與產生一抗的宿主物種不同。

  找到能夠識別一抗的二抗。例如，小鼠一抗需要在另一個宿主物種中產生的抗小鼠二抗。

  選擇與一抗類別或亞類相匹配的二抗。如果單克隆一抗屬于小鼠 IgM 類別，則選擇抗小鼠 IgM 二抗。當一抗的免疫球蛋白類別或亞類未知時，您可以選擇抗小鼠 IgG 二抗。

  選擇特異性高且與非靶標抗體交叉反應性較小的二抗。