當(dāng)您進(jìn)行組織樣本的ELISA實(shí)驗(yàn)時(shí)，蛋白濃度的均一性是非常關(guān)鍵的，因?yàn)榈鞍诐舛鹊牟町惪赡軐?dǎo)致結(jié)果的不一致性。因此，確實(shí)需要對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行蛋白定量以確保各樣品有相同或已知的蛋白濃度。今天，通蔚給大家介紹一下elisa如何定量蛋白濃度，在開(kāi)始之前，我們先知道elisa測(cè)定生物樣品中目標(biāo)蛋白的濃度的三種類型：
  
  定量：可以通過(guò)系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的OD值和相應(yīng)的已知濃度來(lái)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品的 ELISA 數(shù)據(jù)可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線插值來(lái)計(jì)算樣品中目標(biāo)蛋白的濃度。
  
  定性：我們簡(jiǎn)單地從檢測(cè)中得到陰性或陽(yáng)性結(jié)果，通過(guò)與陰性對(duì)照比較來(lái)確定某個(gè)樣品中是否存在任何目標(biāo)蛋白。
  
  半定量：使用這種類型的ELISA 試劑盒，我們可以獲得陰性或陽(yáng)性結(jié)果，并比較檢測(cè)樣品中的目標(biāo)蛋白水平，因?yàn)闃悠返奈舛人綄⒅苯訉?duì)應(yīng)于目標(biāo)蛋白的水平專注。然而，由于試劑盒中沒(méi)有任何標(biāo)準(zhǔn)蛋白，我們無(wú)法計(jì)算出準(zhǔn)確的濃度。
  
  一般來(lái)說(shuō)，使用定量ELISA試劑盒，您可以對(duì)樣品中的目標(biāo)蛋白進(jìn)行定量，因?yàn)槟鷾y(cè)試了一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白。當(dāng)您使用定量 ELISA 試劑盒分析 ELISA 數(shù)據(jù)時(shí)，您必須繪制平均吸光度與蛋白質(zhì)濃度的關(guān)系，并繪制最適合您的標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果的曲線，然后將樣品的吸光度插入曲線以計(jì)算濃度。該 ELISA 標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)方案將為您提供有關(guān)如何使用定量 ELISA 試劑盒逐步計(jì)算 ELISA 結(jié)果的全面說(shuō)明。
  
  關(guān)于樣品中目標(biāo)蛋白的濃度，向您推薦一款使用簡(jiǎn)單的ELISA數(shù)據(jù)分析軟件Curve Expert 1.4。市場(chǎng)上還有許多其他曲線擬合軟件可以進(jìn)行 ELISA 計(jì)算，例如GraphPad Prism，或者您也可以使用普通的 MS Excel 進(jìn)行分析。
  
  一、如何使用Curve Expert繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算目標(biāo)蛋白濃度？
  
  處理 ELISA 數(shù)據(jù)分析分為三個(gè)步驟：
  
  1、將標(biāo)準(zhǔn)品的ELISA數(shù)據(jù)輸入軟件
  
  2、選擇最佳擬合曲線
  
  3、通過(guò)插值計(jì)算目標(biāo)蛋白的濃度
  
  現(xiàn)在我將一步步向您展示如何制作ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線。
  
  1. 將標(biāo)準(zhǔn)品的ELISA數(shù)據(jù)輸入軟件
  
  進(jìn)行 ELISA 測(cè)定后，您可以將原始數(shù)據(jù)分為三個(gè)部分。建議運(yùn)行一式兩份或一式三份的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品。作為zui佳實(shí)踐，您最好將重復(fù)的 CV 控制在 8% 以下。
  
  第1部分：已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度
  
  第 2 部分：空白孔/背景的吸光度
  
  第3部分：未知濃度樣品的吸光度
  
  標(biāo)準(zhǔn)品用樣品稀釋劑連續(xù)稀釋。樣品可能還需要稀釋。由于即使在檢測(cè)波長(zhǎng)處不存在蛋白質(zhì)，樣品稀釋劑也具有吸光度，因此我們?cè)跍y(cè)定中使用樣品稀釋劑進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)以獲得背景 OD。通常的做法是從標(biāo)準(zhǔn)品和所有樣品的吸光度中減去空白孔的吸光度。
  
  這里我們以“Curve Expert 1.4”為例，向您展示如何操作該軟件并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
  
  1.1啟動(dòng)“Curve Expert 1.4”。您可以看到下面的界面。

  該軟件可以輕松定位 x/y 點(diǎn)、微分以及通過(guò)從繪圖菜單中選擇“分析”或按 Ctrl-L 執(zhí)行的曲線擬合積分。在此示例中，我們希望通過(guò)評(píng)估給定 OD（X 值）下的曲線擬合來(lái)找到目標(biāo)蛋白的濃度（Y 值）。只需在“At X=”字段中輸入要評(píng)估曲線擬合的點(diǎn)（x 值），然后按鍵盤上的[ Calculate ] 或 [ Enter ]。然后計(jì)算器將顯示相應(yīng)的 y 值。

  系數(shù)部分給出當(dāng)前模型的相關(guān)參數(shù)值——這些系數(shù)始終表示為 a、b、c、d 等。這些系數(shù)與模型部分中顯示的模型相匹配。如果系數(shù)列表超出了它們顯示的窗口范圍，則會(huì)出現(xiàn)一個(gè)滾動(dòng)條，允許您滾動(dòng)瀏覽參數(shù)。

  將X(OD)、a、b、c、d值分別帶入公式中，然后按鍵盤上的[ Enter ]鍵即可計(jì)算出濃度。為了得到最準(zhǔn)確的結(jié)果，建議預(yù)先確定合適的稀釋倍數(shù)，確保稀釋后樣品中目標(biāo)蛋白的濃度落在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)。如果樣品已被稀釋，則計(jì)算時(shí)應(yīng)考慮稀釋因子。

  標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)于準(zhǔn)確分析 ELISA 結(jié)果非常重要。因此，您應(yīng)該在每次測(cè)定中運(yùn)行標(biāo)準(zhǔn)品，以避免由于每次測(cè)定的操作員、移液、孵育和溫度的差異而導(dǎo)致系統(tǒng)偏差。

  上述是以人TNF-α ELISA試劑盒為例通過(guò)Curve Expert繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算目標(biāo)蛋白濃度，大家可以參考。Curve Expert軟件可能是一個(gè)收費(fèi)的軟件，您可以通過(guò)Excel或其他軟件制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，或者您可以將您的數(shù)據(jù)發(fā)送給我們，我們將為您處理數(shù)據(jù)。如果還有不明白的可以咨詢我們專業(yè)的elisa試劑盒顧問(wèn)尋求免費(fèi)解答！在這里通蔚祝您實(shí)驗(yàn)順利！