原代細(xì)胞是從生物組織或器官直接分離和培養(yǎng)的細(xì)胞，是細(xì)胞研究中不可獲取的一環(huán)。原代細(xì)胞通常混雜著多種細(xì)胞類型，需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康姆蛛x出特定類型的細(xì)胞。原代細(xì)胞分離和純化在初期細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)比較關(guān)鍵。下面上海通蔚生物介紹原代細(xì)胞純化方法，原代細(xì)胞純化方法如下：

  自然純化法：

  原代細(xì)胞在傳代培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)受到培養(yǎng)條件的影響，例如生長(zhǎng)因子、培養(yǎng)基成分等，一些細(xì)胞類型可能在特定條件下具有更強(qiáng)的增殖能力，從而在培養(yǎng)體系中富集，形成所謂的‘自然純化’。這種方法的缺陷在于無(wú)法自由選擇要培養(yǎng)的細(xì)胞，并且無(wú)法保證獲得高純度的特定細(xì)胞類型。因此，需要結(jié)合人工純化方法，例如免疫磁珠分離、流式細(xì)胞術(shù)等，才能有效地分離出目標(biāo)細(xì)胞，并確保其純度和特性。

  人工純化法：

  人工純化方法在細(xì)胞純化方面應(yīng)用廣泛，它通過(guò)各種技術(shù)手段，例如酶消化純化法和機(jī)械刮分法等，利用細(xì)胞本身的特性，或者根據(jù)細(xì)胞的特定性質(zhì)，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)細(xì)胞的富集和分離。

  一、酶消化純化法

  利用特定的酶，例如胰蛋白酶、膠原酶等，來(lái)降解細(xì)胞之間的連接，從而將組織分離成單個(gè)細(xì)胞。這個(gè)過(guò)程需要人工控制酶的濃度、消化時(shí)間等，才能獲得最佳效果。這種純化方法不僅適用于貼壁細(xì)胞，同樣適用于半貼壁細(xì)胞和黏附細(xì)胞等。

  酶消化純化法步驟：

  1.準(zhǔn)備工作：

  將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中預(yù)熱至室溫。

  將0.25%胰蛋白酶溶液置于37℃水浴中預(yù)熱至室溫。

  準(zhǔn)備適量的完全培養(yǎng)基，并置于37℃水浴中預(yù)熱至室溫。

  2.酶消化：

  將原有培養(yǎng)基從細(xì)胞培養(yǎng)瓶中吸出，用PBS緩沖液清洗細(xì)胞一次。

  加入1-2mL預(yù)熱的0.25%胰蛋白酶溶液，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，使胰蛋白酶覆蓋細(xì)胞表面。

  將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化，消化時(shí)間根據(jù)細(xì)胞類型和培養(yǎng)密度而定，通常為5-15分鐘。

  在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，當(dāng)大部分細(xì)胞從培養(yǎng)皿中脫落，呈圓形狀態(tài)時(shí)，即可停止消化。

  3.終止消化：

  加入等量的預(yù)熱的完全培養(yǎng)基，終止胰蛋白酶消化。

  輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞懸液均勻分布。

  將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中。

  4.離心：

  將離心管置于離心機(jī)中，以1000rpm離心5分鐘，收集細(xì)胞沉淀。

  5.重懸細(xì)胞：

  吸出上清液，加入適量的新鮮完全培養(yǎng)基，輕輕吹打細(xì)胞沉淀，使細(xì)胞重懸。

  6.計(jì)數(shù)細(xì)胞：

  使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量，確定細(xì)胞濃度。

  7.接種細(xì)胞：

  將適量的細(xì)胞懸液接種到新的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。

  8.傳代培養(yǎng)：

  當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80-90%匯合度時(shí)，需要進(jìn)行傳代培養(yǎng)，重復(fù)上述步驟。

  二、機(jī)械刮分法

  機(jī)械刮分法則是利用工具，例如刮刀或刷子，將細(xì)胞從培養(yǎng)皿或組織上刮下來(lái)，從而實(shí)現(xiàn)分離。這個(gè)過(guò)程也需要人工操作，需要控制刮分的力度和范圍，避免損傷細(xì)胞。

  機(jī)械刮分法步驟：

  1.準(zhǔn)備工作：

  將培養(yǎng)瓶置于顯微鏡下觀察，確定目標(biāo)細(xì)胞類型和生長(zhǎng)區(qū)域。

  準(zhǔn)備合適的培養(yǎng)基，并置于37℃水浴中預(yù)熱至室溫。

  選擇合適的刮刀或刷子，并進(jìn)行消毒處理。

  2.機(jī)械刮分：

  用無(wú)菌的刮刀或刷子，輕輕刮取非目標(biāo)細(xì)胞所在的區(qū)域，使其懸浮于培養(yǎng)基中。

  操作時(shí)要注意力度，避免損傷目標(biāo)細(xì)胞。

  可以分多次進(jìn)行刮分，每次刮取一小部分非目標(biāo)細(xì)胞，直到將非目標(biāo)細(xì)胞盡可能地分離出來(lái)。

  3.沖洗：

  使用無(wú)菌的吸管吸取培養(yǎng)基，將刮分下來(lái)的非目標(biāo)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中。

  用新鮮的培養(yǎng)基沖洗培養(yǎng)瓶，確保將剩余的非目標(biāo)細(xì)胞沖洗干凈。

  4.離心：

  將離心管置于離心機(jī)中，以1000rpm離心5分鐘，收集細(xì)胞沉淀。

  5.重懸細(xì)胞：

  吸出上清液，加入適量的新鮮完全培養(yǎng)基，輕輕吹打細(xì)胞沉淀，使細(xì)胞重懸。

  6.接種細(xì)胞：

  將細(xì)胞懸液接種到新的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。

  7.重復(fù)操作：

  如果需要進(jìn)一步提高細(xì)胞純度，可以重復(fù)上述步驟，直到獲得滿足實(shí)驗(yàn)要求的純度。

  三、反復(fù)貼壁培養(yǎng)法

  反復(fù)貼壁培養(yǎng)法是一種利用細(xì)胞的貼壁特性進(jìn)行細(xì)胞純化的方法，也稱為差速貼壁法。

  反復(fù)貼壁培養(yǎng)法步驟：

  初始培養(yǎng)：將混合細(xì)胞接種到培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)一段時(shí)間，使貼壁能力強(qiáng)的細(xì)胞附著在培養(yǎng)皿底部。

  去除懸浮細(xì)胞：將培養(yǎng)基和懸浮細(xì)胞吸出，留下貼壁的細(xì)胞。

  重新培養(yǎng)：加入新的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞。

  重復(fù)步驟：重復(fù)步驟2和3，將懸浮細(xì)胞去除，并將貼壁細(xì)胞進(jìn)行再次培養(yǎng)。

  純化：經(jīng)過(guò)多次重復(fù)步驟后，貼壁能力強(qiáng)的細(xì)胞會(huì)逐漸富集，最終獲得相對(duì)純化的細(xì)胞。

  上述是原代細(xì)胞的分離和純化方法介紹，具體選擇哪種純化方法要結(jié)合細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行選擇。上海通蔚生物祝福您在原代細(xì)胞純化中更上一層樓。