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原代細胞純化難題?這些方法幫你搞定!

發布時間:2024-08-22     發布作者:上海通蔚生物

  原代細胞是從生物組織或器官直接分離和培養的細胞,是細胞研究中不可獲取的一環。原代細胞通常混雜著多種細胞類型,需要根據實驗目的分離出特定類型的細胞。原代細胞分離和純化在初期細胞培養時比較關鍵。下面上海通蔚生物介紹原代細胞純化方法,原代細胞純化方法如下:


  自然純化法:


  原代細胞在傳代培養過程中會受到培養條件的影響,例如生長因子、培養基成分等,一些細胞類型可能在特定條件下具有更強的增殖能力,從而在培養體系中富集,形成所謂的自然純化。這種方法的缺陷在于無法自由選擇要培養的細胞,并且無法保證獲得高純度的特定細胞類型。因此,需要結合人工純化方法,例如免疫磁珠分離、流式細胞術等,才能有效地分離出目標細胞,并確保其純度和特性。


  人工純化法:


  人工純化方法在細胞純化方面應用廣泛,它通過各種技術手段,例如酶消化純化法和機械刮分法等,利用細胞本身的特性,或者根據細胞的特定性質,實現對目標細胞的富集和分離。


  一、酶消化純化法


  利用特定的酶,例如胰蛋白酶、膠原酶等,來降解細胞之間的連接,從而將組織分離成單個細胞。這個過程需要人工控制酶的濃度、消化時間等,才能獲得最佳效果。這種純化方法不僅適用于貼壁細胞,同樣適用于半貼壁細胞和黏附細胞等。


  酶消化純化法步驟:


  1.準備工作:


  將細胞培養瓶置于37℃培養箱中預熱至室溫。


  將0.25%胰蛋白酶溶液置于37℃水浴中預熱至室溫。


  準備適量的完全培養基,并置于37℃水浴中預熱至室溫。


  2.酶消化:


  將原有培養基從細胞培養瓶中吸出,用PBS緩沖液清洗細胞一次。


  加入1-2mL預熱的0.25%胰蛋白酶溶液,輕輕搖動培養瓶,使胰蛋白酶覆蓋細胞表面。


  將培養瓶置于37℃培養箱中消化,消化時間根據細胞類型和培養密度而定,通常為5-15分鐘。


  在顯微鏡下觀察細胞形態,當大部分細胞從培養皿中脫落,呈圓形狀態時,即可停止消化。


  3.終止消化:


  加入等量的預熱的完全培養基,終止胰蛋白酶消化。


  輕輕搖動培養瓶,使細胞懸液均勻分布。


  將細胞懸液轉移至離心管中。


  4.離心:


  將離心管置于離心機中,以1000rpm離心5分鐘,收集細胞沉淀。


  5.重懸細胞:


  吸出上清液,加入適量的新鮮完全培養基,輕輕吹打細胞沉淀,使細胞重懸。


  6.計數細胞:


  使用血球計數板計數細胞數量,確定細胞濃度。


  7.接種細胞:


  將適量的細胞懸液接種到新的培養瓶或培養皿中,繼續進行培養。


  8.傳代培養:


  當細胞生長至80-90%匯合度時,需要進行傳代培養,重復上述步驟。


  二、機械刮分法


  機械刮分法則是利用工具,例如刮刀或刷子,將細胞從培養皿或組織上刮下來,從而實現分離。這個過程也需要人工操作,需要控制刮分的力度和范圍,避免損傷細胞。


  機械刮分法步驟:


  1.準備工作:


  將培養瓶置于顯微鏡下觀察,確定目標細胞類型和生長區域。


  準備合適的培養基,并置于37℃水浴中預熱至室溫。


  選擇合適的刮刀或刷子,并進行消毒處理。


  2.機械刮分:


  用無菌的刮刀或刷子,輕輕刮取非目標細胞所在的區域,使其懸浮于培養基中。


  操作時要注意力度,避免損傷目標細胞。


  可以分多次進行刮分,每次刮取一小部分非目標細胞,直到將非目標細胞盡可能地分離出來。


  3.沖洗:


  使用無菌的吸管吸取培養基,將刮分下來的非目標細胞懸液轉移到離心管中。


  用新鮮的培養基沖洗培養瓶,確保將剩余的非目標細胞沖洗干凈。


  4.離心:


  將離心管置于離心機中,以1000rpm離心5分鐘,收集細胞沉淀。


  5.重懸細胞:


  吸出上清液,加入適量的新鮮完全培養基,輕輕吹打細胞沉淀,使細胞重懸。


  6.接種細胞:


  將細胞懸液接種到新的培養瓶或培養皿中,繼續進行培養。


  7.重復操作:


  如果需要進一步提高細胞純度,可以重復上述步驟,直到獲得滿足實驗要求的純度。


  三、反復貼壁培養法


  反復貼壁培養法是一種利用細胞的貼壁特性進行細胞純化的方法,也稱為差速貼壁法。


  反復貼壁培養法步驟:


  初始培養:將混合細胞接種到培養皿中,培養一段時間,使貼壁能力強的細胞附著在培養皿底部。


  去除懸浮細胞:將培養基和懸浮細胞吸出,留下貼壁的細胞。


  重新培養:加入新的培養基,繼續培養貼壁細胞。


  重復步驟:重復步驟23,將懸浮細胞去除,并將貼壁細胞進行再次培養。


  純化:經過多次重復步驟后,貼壁能力強的細胞會逐漸富集,最終獲得相對純化的細胞。


  上述是原代細胞的分離和純化方法介紹,具體選擇哪種純化方法要結合細胞類型和實驗需求進行選擇。上海通蔚生物祝福您在原代細胞純化中更上一層樓。


  

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