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ELISA樣本處理?不同類型ELISA樣本處理方法比較

發(fā)布時(shí)間:2024-09-18     發(fā)布作者:上海通蔚生物

  ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))是一種用于量化樣本中目標(biāo)靶標(biāo)的技術(shù)。常見樣本包括血液(血清和血漿)、組織勻漿、細(xì)胞裂解物和細(xì)胞培養(yǎng)上清液。ELISA獲得的結(jié)果可能受到樣本的收集、處理和儲(chǔ)存方式的影響。本問為您介紹ELISA樣本處理方法。


  目錄


  血液


  組織勻漿


  細(xì)胞裂解物


  細(xì)胞培養(yǎng)上清液


  一、血液


  全血樣本含有多種成分。主要成分是血細(xì)胞(紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板)和血液的液體成分。全血可以離心,使血細(xì)胞與血液分離。根據(jù)血液的制備方式,所得液體將是血清或血漿。


  血清


  血清是血液中不含血細(xì)胞或凝血因子的成分。它本質(zhì)上與血漿相同,但不含纖維蛋白原。凝固的血液會(huì)產(chǎn)生不含纖維蛋白原的血清,但可能殘留一些凝血因子。


  制備方案:


  1.使用血清分離管收集血清,在室溫下靜置1-2小時(shí)或在4°C下靜置過夜。


  注意:血液樣本靜置后會(huì)自然凝結(jié);溫度越低,凝結(jié)過程越慢。


  2.1000×g的速度離心20分鐘。


  3.將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的試管中并立即分析或儲(chǔ)存在4°C(最多一周)、-20°C(最多一個(gè)月)或-80°C(最多兩個(gè)月)下。避免反復(fù)凍融。在進(jìn)行分析前將樣品恢復(fù)至室溫。


  血漿


  血漿是血液的一種成分,構(gòu)成血細(xì)胞(紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板)周圍的細(xì)胞外基質(zhì)。抗凝(未凝固)的血液會(huì)產(chǎn)生血漿,其中包括纖維蛋白原和凝血因子。如果目標(biāo)分析物是凝血因子,建議使用血漿作為樣品類型,而不是血清。


  血漿樣本需要抗凝。抗凝劑的選擇取決于目標(biāo)分析物。通常使用2%EDTA1%肝素或3.8%檸檬酸鈉。應(yīng)避免溶血,因?yàn)檫@會(huì)釋放蛋白酶,從而導(dǎo)致樣本中存在的目標(biāo)分析物降解。高脂質(zhì)濃度會(huì)導(dǎo)致溶血,因此也應(yīng)避免。


  制備方案:


  1.將血漿收集到含有所需抗凝劑的試管中。


  2.收集后30分鐘內(nèi),在2-8°C下以1000×g離心15分鐘。


  3.將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的試管中并立即分析或儲(chǔ)存在4°C(最多一周)、-20°C(最多一個(gè)月)或-80°C(最多兩個(gè)月)下。避免反復(fù)凍融。在進(jìn)行分析前將樣品恢復(fù)至室溫。


  檸檬酸鈉


  血液中的Ca2+通過鈣依賴性凝血途徑促進(jìn)凝血。檸檬酸鈉螯合游離Ca2+離子,抑制這些途徑,從而防止凝血。


  優(yōu)點(diǎn):適用于大多數(shù)情況,不影響凝血因子。


  缺點(diǎn):抗凝作用弱,溶解性差。


  建議用法:檸檬酸鈉(109mmol/L):血液比例為19;或檸檬酸鈉(106mmol/L):血液比例為14


  乙二胺四乙酸


  血液中的Ca2+通過鈣依賴性凝血途徑促進(jìn)凝血。乙二胺四乙酸(EDTA)螯合游離的Ca2+離子,使其不再處于游離狀態(tài),從而阻止凝血。


  優(yōu)點(diǎn):適用于大多數(shù)情況,不影響紅細(xì)胞或白細(xì)胞。


  缺點(diǎn):影響血小板聚集,不適合檢測(cè)凝血或血小板因子。


  建議使用方法:EDTA15g/L):血液比例為1:10


  肝素


  抗凝血酶III是一種抑制凝血途徑中多種酶(主要是絲氨酸蛋白酶)的蛋白質(zhì)。肝素與抗凝血酶III結(jié)合,將其激活,導(dǎo)致抗凝血酶III活性增加,從而增強(qiáng)抗凝血作用。


  優(yōu)點(diǎn):抗凝效果強(qiáng),不改變血細(xì)胞體積,高溫下穩(wěn)定,不易溶血。


  缺點(diǎn):引起白細(xì)胞聚集,抗凝效果短暫。


  建議用法:肝素(1g/L):血液比例為1:10


  二、組織勻漿


  組織勻漿的實(shí)驗(yàn)方案取決于用作樣本的確切組織。可能需要添加蛋白酶抑制劑以防止目標(biāo)分析物降解。一些組織樣本(如肝臟、腎臟、腦組織)可能會(huì)產(chǎn)生假陽性結(jié)果,因?yàn)閮?nèi)源性生物素會(huì)與親和素和鏈霉親和素相互作用。


  制備方案:


  1.用冰冷的PBS沖洗組織以去除多余的血液。在均質(zhì)化之前稱量組織。


  2.將組織切碎,在冰上用組織勻漿器在PBS中勻漿,并對(duì)細(xì)胞懸浮液進(jìn)行超聲處理。


  3.5000×g的速度離心5分鐘,以去除所有沉淀物。


  4.將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的試管中并立即分析或儲(chǔ)存在4°C(最多一周)、-20°C(最多一個(gè)月)或-80°C(最多兩個(gè)月)下。避免反復(fù)凍融。在進(jìn)行分析前將樣品恢復(fù)至室溫。


  三、細(xì)胞裂解物


  細(xì)胞必須先裂解才能進(jìn)行ELISA檢測(cè)。細(xì)胞裂解可通過物理方法(如超聲波或凍融循環(huán))或化學(xué)方法(如RIPATritonX-100NP-40SDS、脫氧膽酸鈉、β-巰基乙醇、DTT、尿素)誘導(dǎo)。通常,物理方法優(yōu)于化學(xué)方法,因?yàn)榛瘜W(xué)洗滌劑會(huì)影響ELISA獲得的結(jié)果。建議使用1%濃度的TritonX-1001%NP-40,因?yàn)檫@足以裂解細(xì)胞,同時(shí)對(duì)ELISA吸光度值沒有或幾乎沒有明顯影響。


  建議方案:


  1.用胰蛋白酶分離貼壁細(xì)胞,然后離心并收集上清液。對(duì)于懸浮細(xì)胞,離心并收集上清液。


  2.用冰冷的PBS清洗細(xì)胞三次,然后用PBS重新懸浮。


  3.用超聲波裂解細(xì)胞四次。或者,將樣品凍融(-20°C至室溫)三次。


  5.2-8°C下以1500×g離心10分鐘,以去除任何細(xì)胞碎片。


  將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的試管中并立即分析或儲(chǔ)存在4°C(最多一周)、-20°C(最多一個(gè)月)或-80°C(最多兩個(gè)月)下。避免反復(fù)凍融。在進(jìn)行分析前將樣品恢復(fù)至室溫。


  四、細(xì)胞培養(yǎng)上清液


  如果目標(biāo)分析物是分泌蛋白,則建議使用細(xì)胞培養(yǎng)上清液作為樣品類型。


  制備方案:


  1.1000×g的速度離心20分鐘,以去除所有沉淀物。


  2.將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的試管中并立即分析或儲(chǔ)存在4°C(最多一周)、-20°C(最多一個(gè)月)或-80°C(最多兩個(gè)月)下。避免反復(fù)凍融。在進(jìn)行分析前將樣品恢復(fù)至室溫。


  上述為大家介紹了常見ELISA樣本處理,正確的樣本處理有助于提高ELISA實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。除了常見的樣本制備之外,根據(jù)目標(biāo)分析物,可以測(cè)試其他樣本,例如皮膚、尿液、糞便、支氣管肺泡灌洗液、胸膜液、唾液、腦脊液等。本篇篇幅有限,下次詳細(xì)介紹。

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