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ELISA技術(shù)支持

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ELISA 實(shí)驗(yàn)過程中的常見問題及解決

發(fā)布時間:2024-07-17     發(fā)布作者:上海通蔚生物

  上篇文章為大家介紹了《ELISA是什么?它能檢測出什么?》。相信大家對ELISA應(yīng)用有所了解,不過在ELISA實(shí)驗(yàn)中難免會出現(xiàn)問題,今天為大家介紹一下ELISA實(shí)驗(yàn)中常見的問題以及對遇到問題的解決辦法。


  ELISA原理之前文章中有闡述,這里再簡要概述一下,了解ELISA原理有助于應(yīng)對實(shí)驗(yàn)遇到問題。


 ELISA


  Elisa的原理


  通過抗原與抗體的特異性免疫反應(yīng)將待測物與酶連接,然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng),用于定量測定。測定的對象可以是抗原也可以是抗體。


  在測定時,受檢標(biāo)本(測定其中的抗體或抗原)與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體,也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后,底物被酶催化水解或氧化還原反應(yīng)而成為有色產(chǎn)物,產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān),故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高,間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果,使測定方法達(dá)到很高的敏感度。


  所生成有色產(chǎn)物的顏色深淺與欲測的抗原(抗體)含量成正比。這種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡觀察,也可以用分光光度計(jì)(酶標(biāo)儀)加以測定。其方法簡單,方便迅速,特異性強(qiáng)。

elisa實(shí)驗(yàn)原理

  Elisa對照


  每次進(jìn)行ELISA時都應(yīng)進(jìn)行對照,以確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。常見的對照包括陽性和陰性對照、空白孔和質(zhì)量控制樣品。陽性對照含有已知量的目標(biāo)抗原,而陰性對照則不含。空白孔不含樣品或試劑,用于測量背景信號。質(zhì)量控制樣品用于驗(yàn)證檢測的準(zhǔn)確度和精密度。


  Elisa問題和解決方案


  空白(B


  ELISA中使用空白對照孔(B)是為了控制板本身的變異,這些孔不接觸任何樣本或檢測抗體。如果空白孔的OD值升高,可能表明洗板存在問題,需要進(jìn)一步調(diào)查。常見原因包括洗板機(jī)故障、底物過量或其他因素。


  零濃度(ZC)


  ELISA中的零濃度對照(ZC)與空白對照(B)類似,但包括檢測中使用的所有緩沖液和試劑,但不包含目標(biāo)抗原。它可以幫助確定檢測的背景信號,對于計(jì)算真正的檢測限(LOD)至關(guān)重要。在實(shí)驗(yàn)運(yùn)行過程中,ZCOD值應(yīng)該保持穩(wěn)定,如果出現(xiàn)明顯變化,需要調(diào)查原因,例如洗板機(jī)故障、試劑問題或其他因素。定期檢查ZC對照的OD值,并及時排查問題,可以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。


  非特異性結(jié)合(NSB)


  NSB對照是ELISA中的另一種對照,它可以評估檢測抗體(標(biāo)記抗體)對總OD信號的非特異性貢獻(xiàn)。在NSB對照中,通常不添加特異性抗原或樣品,而是僅將ELISA板與標(biāo)記抗體和必要的緩沖液(如阻斷緩沖液)孵育。有時,還會采用增強(qiáng)的洗滌步驟來進(jìn)一步減少非特異性結(jié)合。通過這種方式,NSB對照能夠區(qū)分由特異性抗原-抗體結(jié)合產(chǎn)生的信號與由非特異性因素(如標(biāo)記抗體與ELISA板表面的非特異性吸附)產(chǎn)生的背景信號,從而提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。NSB對照的預(yù)期OD值應(yīng)該略高于空白對照(B)孔,但低于零濃度對照(ZC)孔。如果NSB孔的OD值明顯高于預(yù)期,則可能表明標(biāo)記抗體存在非特異性結(jié)合、封閉不充分或其他因素。正確的試劑制備和輸送對NSB對照和整個實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。


  最大結(jié)合(MaxBinding)對照


  最大結(jié)合對照用于估計(jì)檢測所能產(chǎn)生的最大信號。它通過將過量的抗原或標(biāo)準(zhǔn)品加入到微孔板中,確保所有捕獲抗體都被結(jié)合,從而確定信號的上限。最大結(jié)合對照對于計(jì)算樣本的結(jié)合百分比、識別樣本、底物或檢測抗體的問題至關(guān)重要。


  通蔚建議


  Elisa實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致或不準(zhǔn)確的結(jié)果可能是由于各種因素造成的,例如試劑使用不當(dāng)、孵育不均勻、移液技術(shù)不正確、交叉污染以及ELISA試劑盒質(zhì)量低劣。為了確保ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性和準(zhǔn)確性,建議注意以下幾個方面:


  1.試劑管理:


  使用新鮮、適當(dāng)稀釋的試劑,并在移液到板上之前充分混合。


  選擇黑值低、吸附性好的優(yōu)質(zhì)ELISA試劑盒。


  定期校準(zhǔn)儀器,并使用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行質(zhì)量控制。


  2.操作步驟:


  孵育期間使用板密封劑,并避光孵育底物。


  使用移液器時,每次移液前都應(yīng)更換槍頭,并且不要讓移液器接觸孔底,以避免交叉污染。


  確保孵育溫度均勻,避免培養(yǎng)皿堆疊。


  嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作,并記錄實(shí)驗(yàn)過程。


  3.環(huán)境控制:


  避免陽光直射,避免溫度和濕度劇烈變化。


  保持工作區(qū)域清潔,防止污染。


  4.試劑盒質(zhì)量檢測:


  空白對照(B)和零濃度對照(ZC):評估試劑盒的背景信號和檢測限。

  最大結(jié)合對照(MaxBinding):評估試劑盒的靈敏度和飽和度。

  標(biāo)準(zhǔn)品:使用標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證試劑盒的準(zhǔn)確性和精密度。

  重復(fù)性:進(jìn)行多次重復(fù)實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證試劑盒的結(jié)果重復(fù)性。


  最后,ELISA實(shí)驗(yàn)過程遵循良好的實(shí)驗(yàn)室規(guī)范,注意細(xì)節(jié),并使用適當(dāng)?shù)脑噭┨幚砗蛢Υ妫兄谠?/span>ELISA實(shí)驗(yàn)中獲得準(zhǔn)確和一致的結(jié)果。

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