夾心法

夾心法常用于檢測大分子抗原，一般之操作步驟為:

將具有專一性之抗體固著（coating）于塑膠孔盤上，完成后洗去多余抗體

加入待測檢體，檢體中若含有待測之抗原，則其會與塑膠孔盤上的抗體進行專一性鍵結

洗去多余待測檢體，加入另一種對抗原專一之一次抗體，與待測抗原進行鍵結

洗去多余未鍵結一次抗體，加入帶有酵素之二次抗體，與一次抗體鍵結

洗去多余未鍵結二次抗體，加入酵素受質使酵素呈色，以肉眼或儀器讀取呈色結果

間接法

間接法常用于檢測抗體，一般之操作步驟為：

將已知之抗原固著于塑膠孔盤上，完成后洗去多余之抗原。

加入待測檢體，檢體中若含有待測之一次抗體，則其會與塑膠孔盤上的抗原進行專一性鍵結。

洗去多余待測檢體，加入帶有酵素之二次抗體，與待測之一次抗體鍵結。

洗去多余未鍵結二次抗體，加入酵素受質使酵素呈色，藉儀器（ELISA reader）測定塑膠盤中的吸光值（OD值），以評估有色終產物的含量即可測量待測抗體的含量。

競爭法

競爭法是一種較少用到的ELISA檢測機制，一般用于檢測小分子抗原，其操作步驟為：

將具有專一性之抗體固著于塑膠孔盤上，完成后洗去多余抗體

加入待測檢體，使檢體中的待測抗原與塑膠孔盤上的抗體進行專一性鍵結

加入帶有酵素之抗原，此抗原也可與塑膠孔盤上的抗體進行專一性鍵結，由于塑膠孔盤上固著的抗體數量有限，因此當檢體中抗原的量越多，則帶有酵素之抗原可鍵結的固著抗體就越少，亦即，兩種抗原皆競相與塑膠孔盤上抗體鍵結，即所謂競爭法之由來。

洗去檢體與帶有酵素之抗原，加入酵素受質使酵素呈色，當檢體中抗原量越多，代表塑膠孔盤內留下之帶有酵素的抗原越少，顯色也就越淺。

當需要偵測無法獲得兩種以上單一性抗體的抗原，或是不易得到足夠的純化抗體以固著于孔盤上時，一般會考慮使用競爭法ELISA。