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ELISA試劑盒背景值高?別怕!新手也能輕松搞定

發(fā)布時(shí)間:2024-04-18     發(fā)布作者:通蔚生物

  在科研實(shí)驗(yàn)中,在進(jìn)行ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)過程,通常會(huì)遇到一些常見問題——ELISA高背景問題。高背景信號(hào)會(huì)降低 ELISA 的靈敏度和特異性,并影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。它可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果,或掩蓋低濃度待測(cè)物的信號(hào)。因此,減少ELISA背景噪音有助于提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性,為了實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性,下面通蔚生物為大家盤點(diǎn)一些影響因素,對(duì)于噪音困擾,你可以對(duì)照這些因素來試著解決。如果還未解決,也可以尋求我們?cè)诰€技術(shù)顧問。

elisa背景值

  因素一、洗滌不充分


  在ELISA實(shí)驗(yàn)步驟中要涉及到洗滌,如果不充分的洗滌,會(huì)未結(jié)合的物質(zhì)(例如非特異性結(jié)合的抗體或檢測(cè)試劑)殘留在微孔板孔中,它會(huì)增加背景噪音。如有必要,可以通過增加洗滌緩沖液中的鹽濃度來阻止非特異性結(jié)合相互作用。如果背景太高并且您懷疑洗滌步驟不充分,在適當(dāng)?shù)那闆r下向洗滌緩沖液中添加洗滌劑或蛋白質(zhì),或者在兩次洗滌之間浸泡幾分鐘。


  因素二、封閉問題


  在ELISA實(shí)驗(yàn)步驟中涉及到封閉,封閉不充分可產(chǎn)生信號(hào)的抗體非特異結(jié)合的機(jī)會(huì)。這時(shí),我們會(huì)用封閉緩沖液,封閉緩沖液的作用是用非特異性結(jié)合的不相關(guān)蛋白質(zhì)(或多種蛋白質(zhì))浸泡板或微孔中的潛在結(jié)合位點(diǎn)(基本上是任何剩余的粘性點(diǎn))。這隨后減少了信號(hào)產(chǎn)生抗體非特異性結(jié)合的機(jī)會(huì)。


  在實(shí)驗(yàn)之后,你可能會(huì)發(fā)現(xiàn)背景較高,如果您懷疑是封閉不足,您可以嘗試使用更高濃度的封閉劑,或增加封閉時(shí)間。希望阻斷劑不會(huì)掩蓋抗體抗原上的結(jié)合位點(diǎn)。


  市面上的封閉劑分2種類型:蛋白質(zhì)和非離子去垢劑。具體使用哪種類型取決于許多因素,包括板的表面化學(xué)、吸附在其上的抗原、抗體和檢測(cè)試劑。


  最常見的非離子洗滌劑阻滯劑是Tween-20。去垢劑阻滯劑價(jià)格便宜、穩(wěn)定,并且可用于去除洗滌步驟中的一些非特異性結(jié)合。它的缺勢(shì)是它們很容易被洗掉。因此,所有洗滌溶液中也必須添加洗滌劑阻滯劑。注意不要使用高濃度(正常濃度約為0.01-0.1%),這會(huì)減少特異性結(jié)合并產(chǎn)生假陰性。另一種選擇是同時(shí)使用蛋白質(zhì)和非離子洗滌劑阻滯劑,后者可以在洗滌步驟中幫助阻滯。


  與洗滌劑不同,蛋白質(zhì)阻滯劑是永久性的。它們與開放空間結(jié)合并封閉它們,并且還穩(wěn)定與微孔板結(jié)合的抗原分子。洗掉多余的封閉緩沖液后,蛋白質(zhì)封閉劑仍然存在(與去污劑封閉劑不同)。常見的蛋白質(zhì)阻滯劑包括牛血清白蛋白(BSA)、脫脂奶粉、普通全血清和魚明膠。對(duì)于主要的阻斷問題,使用全血清作為阻斷劑可能很有吸引力,因?yàn)檠宄煞止逃械亩鄻有允蛊淠軌蛴行ё钄嘣S多不同類型的分子相互作用。然而,全血清的缺點(diǎn)是它會(huì)與檢測(cè)反應(yīng)中常用的ProteinA和抗IgG抗體發(fā)生交叉反應(yīng)。解決這個(gè)缺點(diǎn)的一個(gè)方法是使用來自雞或魚的完整正常血清。


  其實(shí)封閉是ELISA實(shí)驗(yàn)比較關(guān)鍵的一個(gè)步驟,大家在做實(shí)驗(yàn)時(shí),可以查看你具體使用的封閉試劑,在實(shí)驗(yàn)過程持續(xù)優(yōu)化。


  問題三、抗體濃度過高或低


  抗體濃度過高會(huì)增加非特異性結(jié)合,抗體濃度過低會(huì)降低檢測(cè)靈敏度。大家在進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)之前,可以參考劑盒說明書,商業(yè) ELISA 試劑盒通常會(huì)提供建議的抗體濃度范圍,可以作為參考。


  問題四、檢測(cè)試劑不合理


  在ELISA實(shí)驗(yàn)過程,檢測(cè)試劑使用合理非常重要!使用濃度過高或稀釋不當(dāng),可能會(huì)導(dǎo)致背景較高。不要使用檢測(cè)試劑過度顯色-如有必要,優(yōu)化何時(shí)使用終止液。


  上述是ELISA實(shí)驗(yàn)中背景過高因素及問題優(yōu)化辦法,其實(shí)背景問題不要過于擔(dān)心,在實(shí)驗(yàn)過程多總結(jié)多嘗試這些問題后續(xù)也會(huì)消失!如果在使用ELISA試劑盒遇到問題,也可以和我們?cè)诰€顧問尋求幫助!

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