在科研實(shí)驗(yàn)中，在進(jìn)行ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)過程，通常會遇到一些常見問題——ELISA高背景問題。高背景信號會降低 ELISA 的靈敏度和特異性，并影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。它可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果，或掩蓋低濃度待測物的信號。因此，減少ELISA背景噪音有助于提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，為了實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性，下面通蔚生物為大家盤點(diǎn)一些影響因素，對于噪音困擾，你可以對照這些因素來試著解決。如果還未解決，也可以尋求我們在線技術(shù)顧問。

  因素一、洗滌不充分

  在ELISA實(shí)驗(yàn)步驟中要涉及到洗滌，如果不充分的洗滌，會未結(jié)合的物質(zhì)（例如非特異性結(jié)合的抗體或檢測試劑）殘留在微孔板孔中，它會增加背景噪音。如有必要，可以通過增加洗滌緩沖液中的鹽濃度來阻止非特異性結(jié)合相互作用。如果背景太高并且您懷疑洗滌步驟不充分，在適當(dāng)?shù)那闆r下向洗滌緩沖液中添加洗滌劑或蛋白質(zhì)，或者在兩次洗滌之間浸泡幾分鐘。

  因素二、封閉問題

  在ELISA實(shí)驗(yàn)步驟中涉及到封閉，封閉不充分可產(chǎn)生信號的抗體非特異結(jié)合的機(jī)會。這時，我們會用封閉緩沖液，封閉緩沖液的作用是用非特異性結(jié)合的不相關(guān)蛋白質(zhì)（或多種蛋白質(zhì)）浸泡板或微孔中的潛在結(jié)合位點(diǎn)（基本上是任何剩余的粘性點(diǎn)）。這隨后減少了信號產(chǎn)生抗體非特異性結(jié)合的機(jī)會。

  在實(shí)驗(yàn)之后，你可能會發(fā)現(xiàn)背景較高，如果您懷疑是封閉不足，您可以嘗試使用更高濃度的封閉劑，或增加封閉時間。希望阻斷劑不會掩蓋抗體抗原上的結(jié)合位點(diǎn)。

  市面上的封閉劑分2種類型：蛋白質(zhì)和非離子去垢劑。具體使用哪種類型取決于許多因素，包括板的表面化學(xué)、吸附在其上的抗原、抗體和檢測試劑。

  最常見的非離子洗滌劑阻滯劑是Tween-20。去垢劑阻滯劑價格便宜、穩(wěn)定，并且可用于去除洗滌步驟中的一些非特異性結(jié)合。它的缺勢是它們很容易被洗掉。因此，所有洗滌溶液中也必須添加洗滌劑阻滯劑。注意不要使用高濃度（正常濃度約為0.01-0.1%），這會減少特異性結(jié)合并產(chǎn)生假陰性。另一種選擇是同時使用蛋白質(zhì)和非離子洗滌劑阻滯劑，后者可以在洗滌步驟中幫助阻滯。

  與洗滌劑不同，蛋白質(zhì)阻滯劑是永久性的。它們與開放空間結(jié)合并封閉它們，并且還穩(wěn)定與微孔板結(jié)合的抗原分子。洗掉多余的封閉緩沖液后，蛋白質(zhì)封閉劑仍然存在（與去污劑封閉劑不同）。常見的蛋白質(zhì)阻滯劑包括牛血清白蛋白（BSA）、脫脂奶粉、普通全血清和魚明膠。對于主要的阻斷問題，使用全血清作為阻斷劑可能很有吸引力，因?yàn)檠宄煞止逃械亩鄻有允蛊淠軌蛴行ё钄嘣S多不同類型的分子相互作用。然而，全血清的缺點(diǎn)是它會與檢測反應(yīng)中常用的ProteinA和抗IgG抗體發(fā)生交叉反應(yīng)。解決這個缺點(diǎn)的一個方法是使用來自雞或魚的完整正常血清。

  其實(shí)封閉是ELISA實(shí)驗(yàn)比較關(guān)鍵的一個步驟，大家在做實(shí)驗(yàn)時，可以查看你具體使用的封閉試劑，在實(shí)驗(yàn)過程持續(xù)優(yōu)化。

  問題三、抗體濃度過高或低

  抗體濃度過高會增加非特異性結(jié)合，抗體濃度過低會降低檢測靈敏度。大家在進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)之前，可以參考劑盒說明書，商業(yè) ELISA 試劑盒通常會提供建議的抗體濃度范圍，可以作為參考。

  問題四、檢測試劑不合理

  在ELISA實(shí)驗(yàn)過程，檢測試劑使用合理非常重要！使用濃度過高或稀釋不當(dāng)，可能會導(dǎo)致背景較高。不要使用檢測試劑過度顯色-如有必要，優(yōu)化何時使用終止液。

  上述是ELISA實(shí)驗(yàn)中背景過高因素及問題優(yōu)化辦法，其實(shí)背景問題不要過于擔(dān)心，在實(shí)驗(yàn)過程多總結(jié)多嘗試這些問題后續(xù)也會消失！如果在使用ELISA試劑盒遇到問題，也可以和我們在線顧問尋求幫助！