通蔚生物NADH氧化酶(NOX)測(cè)試盒樣本的前處理

注 意：正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義：
NOX（EC 1.6.99.3）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，可在氧氣存在下，直接將 NADH 氧化
為 NAD。該酶不僅參與 NAD 的再生，而且與免疫反應(yīng)密切相關(guān)。
測(cè)定原理：
NOX 能夠?qū)?NADH 氧化為 NAD，NADH 的氧化與 2,6 二氯酚靛藍(lán)（DCPIP）的還原相偶聯(lián)，藍(lán)色的 DCPIP
被還原為無(wú)色的 DCPIP，在 600nm 下測(cè)定藍(lán)色 DCPIP 的還原速率計(jì)算出 NADH 氧化酶活性的大小。
需自備的儀器和用品：
可見(jiàn)分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰、蒸餾水
試劑的組成和配制：
試劑一：液體 50mL×1 瓶，-20℃保存。
試劑二：液體 10mL×1 瓶，-20℃保存。
試劑三：液體 1mL×1 瓶，-20℃保存。
試劑四：液體 50mL×1 瓶，4℃保存。
試劑五：液體 6 mL×1 瓶，4℃保存。
試劑六：粉劑×2 瓶，-20℃保存；臨用前每瓶加入 5mL 蒸餾水；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)
凍融。
樣本的前處理：
組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：
① 準(zhǔn)確稱取 0.1g 組織或收集 500 萬(wàn)細(xì)胞，加入 1mL 試劑一和 10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
② 將勻漿 600g，4℃離心 5min。
③ 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心 10min。
④ 上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的 NOX（此步可選做）。
⑤ 步驟④中的沉淀即為線粒體，加入 200uL 試劑二和 2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或
200W，超聲 3s，間隔 10 秒，重復(fù) 30 次），用于 NOX 活性測(cè)定。
血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。
測(cè)定步驟：
1、 分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 600nm，蒸餾水調(diào)零。
2、 樣本測(cè)定
（1）試劑四、試劑五和試劑六于 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）孵育 5min。
（2）在 1mL 石英比色皿中加入 40μL 樣本、700μL 試劑四、100μL 試劑五和 160μL 試劑六，混勻，記
錄 600nm 處 20s 時(shí)吸光值 A1 和 1min20s 后的吸光值 A2，計(jì)算 ΔA=A1-A2。
NOX 活力單位的計(jì)算
1、血清（漿）NOX 活力的計(jì)算:
單位的定義：每 mL 血清（漿）在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A600 變化 0.01 定義為一個(gè)酶活力單位。
NOX（U/mL）＝ΔA×V 反總÷V 樣÷0.01÷T=2500×ΔA
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 NOX 活力的計(jì)算:
（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：
單位的定義：每 mg 組織蛋白在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A600 變化 0.01 定義為一個(gè)酶活力單位。
NOX（U/mg prot）=ΔA×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷0.01÷T=2500×ΔA÷Cpr
此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。
（2）按樣本鮮重計(jì)算：
單位的定義：每 g 組織在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A600 變化 0.01 定義為一個(gè)酶活力單位。
NOX（U/g 鮮重）=ΔA×V 反總÷(W× V 樣÷V 樣總)÷0.01÷T=505×ΔA÷W
（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：
單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A600 變化 0.01 定義為一個(gè)酶活力單位。
NOX（U/10?cell）=ΔA×V 反總÷(500×V 樣÷V 樣總)÷0.01÷T=1.01×ΔA
V 反總：反應(yīng)體系總體積，1mL； V 樣：加入樣本體積，0.04mL；V 樣總：加入提取液體積，0.202 mL；

T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬(wàn)。

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