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【通蔚生物】:NADH氧化酶(NOX)測試盒

發(fā)布時間:2024-04-28     發(fā)布作者:上海通蔚生物

通蔚生物NADH氧化酶(NOX)測試盒樣本的前處理
NADH氧化酶(NOX)測試盒
注 意:正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義:
NOX(EC 1.6.99.3)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中,可在氧氣存在下,直接將 NADH 氧化
為 NAD。該酶不僅參與 NAD 的再生,而且與免疫反應(yīng)密切相關(guān)。
測定原理:
NOX 能夠?qū)?NADH 氧化為 NAD,NADH 的氧化與 2,6 二氯酚靛藍(DCPIP)的還原相偶聯(lián),藍色的 DCPIP
被還原為無色的 DCPIP,在 600nm 下測定藍色 DCPIP 的還原速率計算出 NADH 氧化酶活性的大小。
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰、蒸餾水
試劑的組成和配制:
試劑一:液體 50mL×1 瓶,-20℃保存。
試劑二:液體 10mL×1 瓶,-20℃保存。
試劑三:液體 1mL×1 瓶,-20℃保存。
試劑四:液體 50mL×1 瓶,4℃保存。
試劑五:液體 6 mL×1 瓶,4℃保存。
試劑六:粉劑×2 瓶,-20℃保存;臨用前每瓶加入 5mL 蒸餾水;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)
凍融。
樣本的前處理:
組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:
① 準確稱取 0.1g 組織或收集 500 萬細胞,加入 1mL 試劑一和 10uL 試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
② 將勻漿 600g,4℃離心 5min。
③ 棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11000g,4℃離心 10min。
④ 上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白,可用于測定從線粒體泄漏的 NOX(此步可選做)。
⑤ 步驟④中的沉淀即為線粒體,加入 200uL 試劑二和 2uL 試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率 20%或
200W,超聲 3s,間隔 10 秒,重復(fù) 30 次),用于 NOX 活性測定。
血清(漿)樣品:直接檢測。
測定步驟:
1、 分光光度計預(yù)熱 30min 以上,調(diào)節(jié)波長至 600nm,蒸餾水調(diào)零。
2、 樣本測定
(1)試劑四、試劑五和試劑六于 37℃(哺乳動物)或 25℃(其它物種)孵育 5min。
(2)在 1mL 石英比色皿中加入 40μL 樣本、700μL 試劑四、100μL 試劑五和 160μL 試劑六,混勻,記
錄 600nm 處 20s 時吸光值 A1 和 1min20s 后的吸光值 A2,計算 ΔA=A1-A2。
NOX 活力單位的計算
1、血清(漿)NOX 活力的計算:
單位的定義:每 mL 血清(漿)在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A600 變化 0.01 定義為一個酶活力單位。
NOX(U/mL)=ΔA×V 反總÷V 樣÷0.01÷T=2500×ΔA
2、組織、細菌或細胞中 NOX 活力的計算:
(1)按樣本蛋白濃度計算:
單位的定義:每 mg 組織蛋白在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A600 變化 0.01 定義為一個酶活力單位。
NOX(U/mg prot)=ΔA×V 反總÷(V 樣×Cpr)÷0.01÷T=2500×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。
(2)按樣本鮮重計算:
單位的定義:每 g 組織在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A600 變化 0.01 定義為一個酶活力單位。
NOX(U/g 鮮重)=ΔA×V 反總÷(W× V 樣÷V 樣總)÷0.01÷T=505×ΔA÷W
(3)按細菌或細胞密度計算:
單位的定義:每 1 萬個細菌或細胞在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A600 變化 0.01 定義為一個酶活力單位。
NOX(U/10?cell)=ΔA×V 反總÷(500×V 樣÷V 樣總)÷0.01÷T=1.01×ΔA
V 反總:反應(yīng)體系總體積,1mL; V 樣:加入樣本體積,0.04mL;V 樣總:加入提取液體積,0.202 mL;

T:反應(yīng)時間,1 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量;500:細胞或細菌總數(shù),500 萬。

上海通蔚實業(yè)有限公司是一家科研和銷售NADH氧化酶(NOX)測試盒科學(xué)試劑產(chǎn)品,領(lǐng)域涵蓋化學(xué)、分析化學(xué)、生命科學(xué)和材料科學(xué)等基礎(chǔ)創(chuàng)新領(lǐng)域,助力客戶的研究計劃。公司產(chǎn)品有ELISA試劑盒、細胞培養(yǎng)、金標檢測試劑盒、食品檢測試劑盒、分子生物學(xué)試劑盒、胎牛血清、科研抗體、生物耗材等。

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