產(chǎn)品及特點:
枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis),是芽孢桿菌屬的一種。革蘭氏陽性菌, 可形成內(nèi)生抗逆芽孢,芽孢 0.6-0.9×1.0-1.5 微米,橢圓到柱狀,位于菌體中 央或稍偏,芽孢形成后菌體不膨大。生長、繁殖速度較快,菌落表面粗糙不透明, 污白色或微黃色,在液體培養(yǎng)基中生長時,常形成皺醭,是一種需氧菌。可利用 蛋白質(zhì)、多種糖及淀粉,分解色氨酸形成吲哚。在遺傳學(xué)研究中應(yīng)用廣泛,對此 菌的嘌呤核苷酸的合成途徑與其調(diào)節(jié)機(jī)制研究較清楚。廣泛分布在土壤及腐敗的 有機(jī)物中,易在枯草浸汁中繁殖。有的菌株是α淀粉酶和中性蛋白酶的重要生產(chǎn) 菌;有的菌株具有強(qiáng)烈降解核苷酸的酶系,故常作選育核苷生產(chǎn)菌的親株或制取 5'-核苷酸酶的菌種。因此快速靈敏檢測枯草芽孢桿菌有重要意義。
本產(chǎn)品就是以 探針法熒光定量 PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測枯草芽孢桿菌的試劑盒。
1. 即開即用,用戶只需要提供樣品 DNA 模板。
2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化,靈敏性高。
3. 提供陽性對照,便于區(qū)分假陰性樣品。
4. 特異性高,引物是根據(jù)枯草芽孢桿菌高度保守區(qū)設(shè)計。
5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應(yīng)。
規(guī)格及成分:
編號
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成分
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規(guī)格
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試劑一
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2×Probe qPCR MagicMix
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500μL(本色蓋)
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試劑三
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熒光PCR專用模板稀釋液
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1mL(黃蓋)
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試劑二
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枯草芽孢桿菌qPCR引物混合液
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100μL(白蓋)
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試劑四
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枯草芽孢桿菌qPCR探針
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50μL(棕色管)
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試劑五
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枯草芽孢桿菌探針法qPCR陽性對照(1×10E8/μL)
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50μL(紅蓋)
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使用手冊
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1份
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運輸及保存:
低溫運輸,-20℃保存,保存期限為 12 個月。
自備試劑:
樣品DNA。
使用方法:
一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品(以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例):
由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進(jìn)行,千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原, 本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照,只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對照。
1. 標(biāo)記 6 個離心管,分別為 7,6,5,4,3,2。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液,最好用帶芯槍頭, 下同)。
3. 在 7 號管中加入 5 μL1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供),充分震 蕩 1 分鐘,得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭,在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭,在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品DNA的制備:
7. 如果有 N 個樣品,最好設(shè)置 N+2 個提取,多出的一個是 PC(樣品制備陽性 對照),一個是 NC(樣品制備陰性對照)。可以用 10μL 陽性對照的 10000 倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,以此作為 PC。另外用水作為 NC。
8. 用自選方法純化樣品的 DNA,本試劑盒跟市場上大多數(shù) DNA 提取試劑盒兼容。
三、Probe qPCR反應(yīng)(20μL體系,在樣品制備室進(jìn)行):
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù),則標(biāo)記 N+9 個 PCR 管,其中 N+2 個 用于上步得到的 N+2 個樣品,1 個用于 PCR 陰性對照(用水做模板),6 個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析,并且只做 1 次重復(fù),則標(biāo)記 N+4 個 PCR 管,其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品,1 個用于 PCR 陰性對照(用 水做模板),1 個用于 PCR 陽性對照(用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模 板)。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
10. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè) 置完畢后才設(shè)置陽性對照,并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好 后最后加):
成份
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N+2個樣品管
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PCR陰性對照管
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標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品管2-7管
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2×Probe qPCR MagicMix
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10μL
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10μL
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各10μL
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枯草芽孢桿菌qPCR探針
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1μL
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1μL
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各1μL
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枯草芽孢桿菌探針法qPCR引物混合液
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2μL
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2μL
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各2μL
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N+2個待測DNA模板
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7μL
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超純水
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7μL
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第7步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液2-7號
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各7μL2號樣到2號管,3號樣到3號管
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11. 蓋上蓋子后上機(jī),按下面參數(shù)進(jìn)行PCR:
過程
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溫度
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時間
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預(yù)變性
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95℃
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3 min
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PCR反應(yīng)40個循環(huán)
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95℃
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15 sec
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60℃
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1 min(采集FAM通道的熒光信號)
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四、數(shù)據(jù)處理:
12. 如果把本試劑盒用于定量檢測,則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸,以 Ct 值為縱軸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 RNA濃度的 log 值,再推算出其濃度。
13. 如果把本試劑盒用于定性檢測,只判斷陽性或陰性,則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長,有典型擴(kuò)增曲線,Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對待測樣品,如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性,如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間,則重復(fù)一次。若重復(fù)結(jié)果 Ct值小于 40,擴(kuò)增曲線有明顯起峰,該樣本判斷為陽性,否則為陰性。
五、特別提示:
本公司的所有產(chǎn)品,僅可用于科研實驗,嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途!