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品質保證 · 通蔚試劑

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產品中心

  • 節瘤擬桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒

    規格:
    數量:

    購買數量

    • 品牌 : 通蔚生物
    • 目錄號 : TW40292
    • 應用 : 僅供科研使用
    • 保存條件 : 低溫/避光保存
    • 貨期 : 現貨
    • 商品庫存:100
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產品及特點:
節瘤擬桿菌(Dichelobacter nodosus)是引起牛、羊、鹿等反芻動物腐蹄病的原發性病原菌,腐蹄病是危害反芻動物養殖業發展的重要疾病之一,節瘤擬桿菌引起動物局部淺表損害,病程緩慢,機體抗體反應延遲,抗體產生量少。節瘤擬桿菌是通過Ⅳ型纖毛和細胞外蛋白酶而產生作用。但從腐蹄病發病癥狀看,節瘤擬桿菌所致疾病的嚴重程度不是相同的,據此節瘤擬桿菌被分為毒性,弱毒性和良性菌這種分類通過對該菌基因組毒性關聯蛋白Vap(Virulence—associated protein)區域和毒性相關位點vrl(Virulence Related Locus)區域,發現其致病特點與基因的順序有很大聯系。因此快速檢測節瘤擬桿菌具有重要意義。
因此快速檢測節瘤擬桿菌具有重要意義。本產品就是以探針法熒光定量 PCR 技術為基礎開發的專門檢測節瘤擬桿菌的試劑盒,它具有下列特點:
1. 即開即用,用戶只需要提供樣品 DNA 模板。
2. 引物和探針經過優化,靈敏性高。
3. 提供陽性對照,便于區分假陰性樣品。
4. 特異性高,引物是根據節瘤擬桿菌高度保守區設計,不會跟其他病毒 DNA發生交叉反應。
5. 本產品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應。
規格及成分:

編號

成分

規格

試劑一

2×Probe qPCR MagicMix

500μL(本色蓋)

試劑

熒光PCR專用模板稀釋液

1mL(黃蓋)

試劑二

節瘤擬桿菌探針法qPCR引物混合液

100μL(白蓋)

試劑四

節瘤擬桿菌探針法qPCR探針

50μL(棕色管)

試劑五

節瘤擬桿菌探針法qPCR陽性對照(1×10E8/μL)

50μL(紅蓋)

 

使用手冊

1份

運輸及保存:
低溫運輸,-20℃保存,保存期限為 12 個月。
自備試劑:
樣品DNA。
使用方法:
一、稀釋標準曲線樣品(以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例):
由于標準品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行,千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原,本產品不提供活體樣品做陽性對照,只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。
1. 標記 6 個離心管,分別為 7,6,5,4,3,2。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液,最好用帶芯槍頭,下同)。
3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭,在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭,在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。
6. 放冰上待用。重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品DNA的制備: 
7. 如果有 N 個樣品,最好設置 N+2 個提取,多出的一個是 PC(樣品制備陽性對照),一個是 NC(樣品制備陰性對照)。可以用 10μL 陽性對照的 10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,以此作為PC。另外用水作為 NC。
8. 用自選方法純化樣品的 DNA,本試劑盒跟市場上大多數 DNA 提取試劑盒兼容。
三、Probe qPCR反應(20μL體系,在樣品制備室進行):
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復,則標記 N+9 個 PCR 管,其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品,1 個用于 PCR 陰性對照(用水做模板),6個用于標準曲線。如果做定性分析,并且只做 1 次重復,則標記 N+4 個 PCR管,其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品,1 個用于 PCR 陰性對照(用水做模板),1 個用于 PCR 陽性對照(用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板)。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
10. 在標記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照,并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加):

成份

N+2個樣品管

PCR陰性對照管

標準曲線樣品管2-7管

2×Probe qPCR MagicMix

10μL

10μL

10μL

節瘤擬桿菌探針法qPCR探針

1μL

1μL

1μL

節瘤擬桿菌qPCR引物混合液

2μL

2μL

2μL

N+2個待測DNA模板

7μL

--

--

超純水

--

7μL

--

7步所得標準曲線樣品稀釋液2-7號

--

--

7μL2號樣到2號管,3號樣到3號管

11. 蓋上蓋子后上機,按下面參數進行PCR:

過程

溫度

時間

預變性

95℃

3 min

PCR反應40個循環

95℃

15 sec

60

1 min(采集FAM通道的熒光信號)

四、數據處理:
12. 如果把本試劑盒用于定量檢測,則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸,以 Ct 值為縱軸,繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 RNA濃度的 log 值,再推算出其濃度。
13. 如果把本試劑盒用于定性檢測,只判斷陽性或陰性,則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數增長,有典型擴增曲線,Ct 值應該小于或等于 30。對待測樣品,如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性,如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間,則重復一次。若重復結果 Ct值小于 40,擴增曲線有明顯起峰,該樣本判斷為陽性,否則為陰性。 
五、特別提示:
本公司的所有產品,僅可用于科研實驗,嚴禁用于臨床醫療及其他非科研用途!
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