猴病毒40探針法熒光定量PCR試劑盒

產品及特點：

猴病毒 40（Simian Virus 40,SV40）是球形動物病毒，它的基因組常用來作為克隆載體，把外源 DNA 轉入哺乳類細胞。猴病毒 40 在猴子身上被發(fā)現(xiàn)。自發(fā)現(xiàn)猴病毒 40 以來的近 20 年中，蘇聯(lián)陸續(xù)將這些可能被污染了猴病毒 40 的小兒麻痹癥疫苗賣給其東歐聯(lián)盟國家以及亞洲和非洲國家。從 1963 年發(fā)現(xiàn)猴病毒 40 后，幾千萬人已感染猴病毒 40。掌握該病的流行狀況、開展相應的診斷檢測技術研究以及制訂相關技術標準不僅十分必要而且迫在眉睫。本產品是以探針法熒光定量PCR 技術為基礎開發(fā)的專門檢測猴病毒 40 的試劑盒。

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。

2. 引物和探針經過優(yōu)化，靈敏性高。

3. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4. 特異性高，引物是根據(jù)猴病毒40 高度保守區(qū)設計，不會跟其他病毒 DNA發(fā)生交叉反應。

5. 本產品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應。

規(guī)格及成分：

編號	成分	規(guī)格
試劑一	2×Probe qPCR MagicMix	500μL(本色蓋)
試劑二	熒光PCR專用模板稀釋液	1mL(黃蓋)
試劑三	猴病毒40 qPCR引物混合液	100μL(白蓋)
試劑四	猴病毒40 qPCR探針	50μL(棕色管)
試劑五	猴病毒40 探針法qPCR陽性對照(1×10E8/μL)	50μL(紅蓋)
使用手冊		1 份

運輸及保存：

低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。

自備試劑：

樣品DNA。

使用方法：

一、稀釋標準曲線樣品(以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例)：

由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。

1. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。

3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。

6. 放冰上待用。重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品DNA的制備：

7. 如果有 N 個樣品，最好設置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）。可以用 10μL 陽性對照的 10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為 NC。

8. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù) DNA 提取試劑盒兼容。

三、Probe qPCR反應(20μL體系，在樣品制備室進行)：

9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個 PCR管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：

成份	N+2 個樣品管	PCR 陰性對照管	標準曲線樣品管 2-7管
2×Probe qPCR MagicMix	10μL	10μL	各10μL
猴病毒40 qPCR探針	1μL	1μL	各1μL
猴病毒40 探針法qPCR引物混合液	2μL	2μL	各2μL
N+2個待測DNA模板	7μL	--	--
超純水	--	7μL	--
第7步所得標準曲線樣品稀釋液2-7號	--	--	各7μL2號樣到2號管,3號樣到3號管

11. 蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行PCR：

過程	溫度	時間
預變性	95℃	3 min
PCR反應40個循環(huán)	95℃	15 sec
PCR反應40個循環(huán)	60℃	1 min(采集FAM通道的熒光信號)

四、數(shù)據(jù)處理：

12. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 RNA濃度的 log 值，再推算出其濃度。

13. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復一次。若重復結果 Ct值小于 40，擴增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽性，否則為陰性。

五、特別提示：

本公司的所有產品，僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

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猴病毒40探針法熒光定量PCR試劑盒說明書
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