甲型流感(禽流感)病毒H5N1亞型染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

產(chǎn)品及特點(diǎn)：

1. 一站式，用于不需要單獨(dú)準(zhǔn)備每種成分，包括引物和對(duì)照。

2. 根據(jù)甲型流感(禽流感)病毒H5N1亞型的保守基因序列設(shè)計(jì)的引物，具有良好的特異性。

3. 基于染料法 qRT-PCR 檢測(cè)，靈敏度比常規(guī) RT-PCR 高 10-100 倍，可以達(dá)到至少 1000 拷貝/反應(yīng)。

4. 使用一管式 qRT-PCR 技術(shù)，RT 和 PCR 兩步在一個(gè)試管內(nèi)完成，不需要中間轉(zhuǎn)移樣品，降低了操作誤差和可能的污染。

5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 30μL 體系的 RT-PCR。

規(guī)格及成分：

編號(hào)	成分	規(guī)格
試劑一	2×qRT-PCR 緩沖液	500 μL(棕色管)
試劑二	10×qRT-PCR 酶混合液	100 μL(紅蓋)
試劑三	ROX 染料 I，50×	20 μL(棕色管)
試劑四	ROX 染料 II，50×	20 μL(棕色管)
試劑五	熒光 PCR 專(zhuān)用模板稀釋液	1mL(黃蓋)
試劑六	甲型流感(禽流感)病毒H5N1亞型染料法 qRT-PCR 引物混合液	100 μL(白蓋)
試劑七	甲型流感(禽流感)病毒H5N1亞型染料法 qRT-PCR 陽(yáng)性對(duì)照 (1×10E8/μL)	50 μL(黃蓋)
試劑八	沙核酸釋放劑(試用裝)	20 次(1mL，綠蓋)

運(yùn)輸及保存：

低溫運(yùn)輸、-20℃保存，有效期一年。

陽(yáng)性對(duì)照需要因易污染其他成分需要單獨(dú)放置。本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照，只提供 DNA 片段作為陽(yáng)性對(duì)照。

自備試劑：

樣品 RNA。

使用方法：

一、稀釋陽(yáng)性對(duì)照：

以 10E2-10E7 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例，由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原。

1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專(zhuān)用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同)。

2. 在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(本試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。

3. 換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。

4. 換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。

二、樣品 DNA 的制備：

5. 如果有 N 個(gè)樣品，必須設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是 PC(樣品制備陽(yáng)性對(duì)照)，一個(gè)是 NC(樣品制備陰性對(duì)照)。可以用 10μL 上步制備的陽(yáng)性對(duì)照梯度稀釋液中的第 4 號(hào)(濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL 相當(dāng)于 1 萬(wàn)拷貝)再加上一定量的水作為制備的陽(yáng)性對(duì)照(加水后其總體積跟樣品一樣，樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求)。可以用水作為制備的陰性對(duì)照。

6. 用自選方法純化 N+2 個(gè)樣品的 RNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒 RNA 提取試劑盒兼容。

三、設(shè)置RT-PCR 反應(yīng)（20 μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）：

7. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照，6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照(用水做模板)，1 個(gè)用于 PCR 陽(yáng)性對(duì)照(用第 4 號(hào)陽(yáng)性對(duì)照稀釋液做模板)。下面只描述定量分析的步驟，定性分析只是把 6 個(gè)標(biāo)曲反應(yīng)縮減成 1 個(gè)，其余不變。

8. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子后最后加)：

成分	N+2個(gè)制備所得樣品	qRT-PCR 陰性對(duì)照	qRT-PCR陽(yáng)性對(duì)照(2-7管)
2×qRT-PCR緩沖液	10μL	10μL	各10μL
甲型流感(禽流感)病毒H5N1亞型染料法qRT-PCR引物混合物	2μL	2μL	各2μL
50×ROX (見(jiàn)注)	0.4μL	0.4μL	各0.4μL
樣品制備所得RNA 模板(來(lái)于第8步)	5.6μL	--	--
稀釋所得6個(gè)陽(yáng)性對(duì)照(來(lái)于第6步)	--	--	各5.6μL2號(hào)樣到2號(hào) 管,3號(hào)樣到3號(hào)管
超純水	--	5.6μL	--
10×qRT-PCR酶混合液	2μL	2μL	2μL

注：需使用 ROX 染料 I 的機(jī)型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-One Plus。

需使用 ROX 染料 II 的機(jī)型：ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research的 Chromo4、Opticon(II)Corbett Rotor Gene 3000。

不需要使用ROX 的機(jī)型：Thermal Cycle Dice Real Time System，LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene3000、RotorGene 6000。

9. 上機(jī)后按下面參數(shù)進(jìn)行 RT-PCR(參數(shù)可能會(huì)因儀器不同而需優(yōu)化)。

過(guò)程	溫度	時(shí)間
RT（逆轉(zhuǎn)錄）	50℃	15-30 min
預(yù)變性	95℃	5 min
Qrt-PCR反應(yīng)40個(gè)循環(huán)	95℃	15 sec
Qrt-PCR反應(yīng)40個(gè)循環(huán)	58℃	1 min,（采集FAM通道的熒光信號(hào)）
按儀器預(yù)設(shè)程序進(jìn)行溶解曲線分析

四、數(shù)據(jù)處理：

10. 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA濃度的 log 值，再推算出其濃度。

11. 如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽(yáng)性或陰性，則陰性對(duì)照 Ct 必須大于或等于 40。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對(duì)待測(cè)樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽(yáng)性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽(yáng)性。

五、特別提示：

本公司的所有產(chǎn)品，僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

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甲型流感(禽流感)病毒H5N1亞型染料法熒光定量RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)
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