日本腦炎病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

產品及特點：

日本腦炎病毒(Japanese Encephalitis Virus,JEV)是一種RNA病毒，也是流行性乙型腦炎的病原體，在低溫條件下，該病毒能自下而上較長時間，在動物、雞胚及組織培養細胞中均能增殖。幼豬是乙腦病毒的主要傳染源和中間宿主，蚊子是乙腦病毒的傳播媒介。當人受帶病毒的蚊子叮咬后，乙腦病毒進入人體，在血管內皮細胞、淋巴結、肝、脾等吞噬細胞內增殖，并經血液循環到達腦部而引起炎癥，因此日本腦炎病毒的快速準確鑒定對該病的預防和檢疫有著重要作用。本產品基于PCR原理開發。

1. 一站式，用于不需要單獨準備每種成分，包括引物和對照。

2. 根據日本腦炎病毒的保守基因序列設計的引物，具有良好的特異性。

3. 基于染料法 qRT-PCR 檢測，靈敏度比常規 RT-PCR 高 10-100 倍，可以達到至少 1000 拷貝/反應。

4. 使用一管式 qRT-PCR 技術，RT 和 PCR 兩步在一個試管內完成，不需要中間轉移樣品，降低了操作誤差和可能的污染。

5. 本產品足夠 50 次 30μL 體系的 RT-PCR。

規格及成分：

編號	成分	規格
試劑一	2×qRT-PCR 緩沖液	500 μL(棕色管)
試劑二	10×qRT-PCR 酶混合液	100 μL(紅蓋)
試劑三	ROX 染料 I，50×	20 μL(棕色管)
試劑四	ROX 染料 II，50×	20 μL(棕色管)
試劑五	熒光 PCR 專用模板稀釋液	1mL(黃蓋)
試劑六	日本腦炎病毒染料法 qRT-PCR 引物混合液	100 μL(白蓋)
試劑七	日本腦炎病毒染料法 qRT-PCR 陽性對照 (1×10E8 /μL)	50 μL(黃蓋)
試劑八	沙核酸釋放劑(試用裝)	20 次(1mL，綠蓋)
試劑九	使用手冊	1 份

運輸及保存：

低溫運輸、-20℃保存，有效期一年。

陽性對照需要因易污染其他成分需要單獨放置。本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供 DNA 片段作為陽性對照。

自備試劑：

樣品 RNA。

使用方法：

一、稀釋陽性對照：

以 10E2-10E7 這 6 個 10 倍稀釋度為例，由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原。

1. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同)。

2. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(本試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

3. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

4. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。

二、樣品 DNA 的制備：

5. 如果有 N 個樣品，必須設置 N+2 個提取，多出的一個是 PC(樣品制備陽性對照)，一個是 NC(樣品制備陰性對照)。可以用 10μL 上步制備的陽性對照梯度稀釋液中的第 4 號(濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL 相當于 1 萬拷貝)再加上一定量的水作為制備的陽性對照(加水后其總體積跟樣品一樣，樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求)。可以用水作為制備的陰性對照。

6. 用自選方法純化 N+2 個樣品的 RNA，本試劑盒跟市場上大多數病毒 RNA 提取試劑盒兼容。

三、設置RT-PCR 反應（20 μL 體系，在樣品制備室進行）：

7. 如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照，6 個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照(用水做模板)，1 個用于 PCR 陽性對照(用第 4 號陽性對照稀釋液做模板)。下面只描述定量分析的步驟，定性分析只是把 6 個標曲反應縮減成 1 個，其余不變。

8. 在標記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子后最后加)：

成分	N+2個制備所得樣品	qRT-PCR 陰性對照	qRT-PCR陽性對照(2-7管)
2×qRT-PCR緩沖液	10μL	10μL	各10μL
日本腦炎病毒染料法qRT-PCR引物混合物	2μL	2μL	各2μL
50×ROX (見注)	0.4μL	0.4μL	各0.4μL
樣品制備所得RNA 模板(來于第8步)	5.6μL	--	--
稀釋所得6個陽性對照 (來于第6步)	--	--	各5.6μL2號樣到2號管,3號樣到3號管
超純水	--	5.6μL	--
10×qRT-PCR酶混合液	2μL	2μL	2μL

注：需使用 ROX 染料 I 的機型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-One Plus。

需使用 ROX 染料 II 的機型：ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research的 Chromo4、Opticon(II)Corbett Rotor Gene 3000。

不需要使用ROX 的機型：Thermal Cycle Dice Real Time System，LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene3000、RotorGene 6000。

9. 上機后按下面參數進行 RT-PCR(參數可能會因儀器不同而需優化)。

過程	溫度	時間
RT（逆轉錄）	50℃	15-30 min
預變性	95℃	5 min
Qrt-PCR反應40個循環	95℃	15 sec
Qrt-PCR反應40個循環	58℃	1 min,（采集FAM通道的熒光信號）
按儀器預設程序進行溶解曲線分析

四、數據處理：

10. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 DNA濃度的 log 值，再推算出其濃度。

11. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復一次。重復實驗的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽性。

五、特別提示：

本公司的所有產品，僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫療及其他非科研用途！

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日本腦炎病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒說明書
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