產(chǎn)品及特點：

牛病毒性腹瀉病毒(Bovine Viral Diarrhea Virus ,BVDV)是引起牛、羊和豬的一種接觸性傳染病。牛、羊以消化道黏膜糜爛、壞死，胃腸炎和腹瀉為特征；豬則表現(xiàn)為懷孕母豬的不孕、產(chǎn)仔數(shù)下降和流產(chǎn)，以及仔豬的生長遲緩和先天性震顫等。牛以發(fā)熱、白細胞減少、口腔及消化道粘膜糜爛、壞死和腹瀉為特征，但大多數(shù)牛是隱性感染。本病呈世界分布，我國從美國、丹麥、西德、新西蘭等十多個國家引進種牛，分離鑒定出了病毒。我國已在很多省內(nèi)流行該病。該病毒具有較大的變異性，根據(jù)病毒基因組結(jié)構(gòu)特點分為 2 個基因型，即 BVDV-1 和BVDV-2。因此牛病毒性腹瀉病毒的快速準確鑒定對該病的預防和檢疫有著重要作用。

本產(chǎn)品以探針法熒光定量 RT-PCR 技術(shù)為基礎開發(fā)的專門檢測牛病毒性腹瀉病毒1型的試劑盒，它具有下列特點：

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 RNA 模板。

2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性高。

3. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4. 特異性高，引物是根據(jù)牛病毒性腹瀉病毒1型高度保守區(qū)設計，不會跟其他病毒的RNA發(fā)生交叉反應。

5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 RT-PCR 反應。

6. 本產(chǎn)品只能用于科研。

規(guī)格及成分：

編號	成分	規(guī)格
試劑一	探針法 qRT-PCR 緩沖液	500 μL（藍蓋）
試劑二	探針法 qRT-PCR 酶混合液	100 μL（紅蓋）
試劑三	熒光 PCR 專用模板稀釋液	1 mL（黃蓋）
試劑四	牛病毒性腹瀉病毒1型探針法qRT-PCR引物混合液	100 μL（白蓋）
試劑五	牛病毒性腹瀉病毒1型 qRT-PCR 探針	50 μL（棕色管）
試劑六	牛病毒性腹瀉病毒1型探針法qRT-PCR陽性對照 (1×10E8 /μL)	50 μL（黃蓋）
使用手冊		1 份

運輸及保存：

低溫運輸、-20℃保存，有效期一年。

自備試劑：

樣品 RNA。

使用方法：

一、稀釋標準曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）：

由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。

1. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 RT-PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。

3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

6. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品 RNA 的制備：

7. 如果有 N 個樣品，最好設置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）。可以用 10μL 陽性對照的 10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為 NC。

8. 用自選方法純化樣品的 RNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒 RNA 提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的柱式病毒 RNAout。

三、Probe qRT-PCR 反應（20μL 體系，在樣品制備室進行）：

9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個 PCR管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：

成份	樣品管 N+2個	RT-PCR 陰性對照管	標準曲線樣品管2-7管
探針法 qRT-PCR 緩沖液	各 10 μL	10 μL	各 10 μL
探針法 qRT-PCR 酶混合液	各 2 μL	2 μL	各 2 μL
牛病毒性腹瀉病毒1型 qRT-PCR 探針	各 1 μL	1 μL	各 1 μL
牛病毒性腹瀉病毒1型探針 qRT-PCR引物混合液	各 2 μL	2 μL	各 2 μL
待測樣品 RNA 模板	各 5 μL	--	--
超純水	--	5 μL	--
第7步所得標準曲線樣品稀釋液2-7號	不加	不加	各5 μL (2號樣到2號管，3號樣到3號管)

11. 蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行 qRT-PCR：

過程	溫度	時間
逆轉(zhuǎn)錄	50℃	30 min
預變性	94℃	10 min
qRT-PCR反應35個循環(huán)	94℃	15 sec
qRT-PCR反應35個循環(huán)	60℃	1 min，(采集FAM通道的熒光信號)

四、數(shù)據(jù)處理：

12. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品RNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

13. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復一次。重復實驗的 Ct值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽性。

五、特別提示：

本公司的所有產(chǎn)品，僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

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牛病毒性腹瀉病毒1型探針法熒光定量RT-PCR試劑盒說明書
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