柑橘黃龍病菌亞洲種探針法熒光定量PCR試劑盒

產品及特點：

柑橘黃龍病菌亞洲種（Candidatus Liberobacter Asiaticus）是一種類菌體，柑橘感染黃龍病后，全年均可發生，一般以夏梢和秋梢發病最多，其次是春梢。新梢的癥狀是葉片表現黃化和黃綠相間的斑駁。在葉片凋落后，枝梢上新長出的葉片表現缺素狀的花葉。病梢變短、生勢衰弱，病葉黃厚、變小，且易脫落，形成枯枝。開花不適時，花開的多、落得多。果小而畸形，或紅鼻果。后期，根部往往表現為小根腐爛。此菌可以侵染蕓香科柑橘屬和金橘屬植物，引發癥狀。通過菟絲子，此菌可以侵染長春花。在自然界，蕓香科蠔殼刺屬和木蘋果屬植物可能受此菌侵染，九里香屬植物常見著生大量傳播柑橘黃龍病的柑橘木虱，但其體內未見病原菌。因此柑橘黃龍病菌的快速準確鑒定對該病的預防和治療有著重要作用。本產品就是以探針法熒光定量PCR技術為基礎開發的專門檢測柑橘黃龍病菌的試劑盒。

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。

2. 引物和探針經過優化，靈敏性高。

3. 提供陽性對照，便于區分假陰性樣品。

4. 特異性高，引物是根據柑橘黃龍病菌亞洲種高度保守區設計，不會跟其他病毒 DNA發生交叉反應。

5. 本產品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應。

規格及成分：

編號	成分	規格
試劑一	2×Probe qPCR MagicMix	500μL(本色蓋)
試劑三	熒光PCR專用模板稀釋液	1 mL(黃蓋)
試劑二	柑橘黃龍病菌亞洲種qPCR引物混合液	100μL(白蓋)
試劑四	柑橘黃龍病菌亞洲種qPCR探針	50μL(棕色管)
試劑五	柑橘黃龍病菌亞洲種探針法qPCR陽性對照(1×10E8/μL)	50μL(紅蓋)
	使用手冊	1 份

運輸及保存：

低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。

自備試劑：

樣品DNA。

使用方法：

一、稀釋標準曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）：

由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。

1. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。

3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。

6. 放冰上待用。重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品DNA的制備：

7. 如果有 N 個樣品，最好設置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）。可以用 10μL 陽性對照的 10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為 NC。

8. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數 DNA 提取試劑盒兼容。

三、Probe qPCR反應（20μL體系，在樣品制備室進行）：

9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個 PCR管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：

成份	N+2個樣品管	PCR陰性對照管	標準曲線樣品管2-7管
2×ProbeqPCRMagicMix	10μL	10μL	各10μL
柑橘黃龍病菌亞洲種qPCR探針	1μL	1μL	各1μL
柑橘黃龍病菌亞洲種探針法qPCR引物混合液	2μL	2μL	各2μL
N+2個待測DNA模板	7μL	--	--
超純水	--	7μL	--
第7步所得標準曲線樣品稀釋液(2-7號)	--	--	各7μL2號樣到2號管,3號樣到3號管

11. 蓋上蓋子后上機，按下面參數進行PCR：

過程	溫度	時間
預變性	95℃	3 min
PCR反應40個循環	95℃	15 sec
PCR反應40個循環	60℃	1 min（采集FAM通道的熒光信號）

四、數據處理：

12. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 RNA濃度的 log 值，再推算出其濃度。

13. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復一次。若重復結果 Ct值小于 40，擴增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽性，否則為陰性。

五、特別提示：

本公司的所有產品，僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫療及其他非科研用途！

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柑橘黃龍病菌亞洲種探針法熒光定量PCR試劑盒說明書
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