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產(chǎn)品及特點(diǎn)：
刺激隱核蟲(chóng)（Cryptocaryon irritans） 又叫海水小瓜蟲(chóng)，屬原生動(dòng)物門、纖毛亞門、寡膜纖毛綱、膜口亞綱、膜口目、凹口科、隱核蟲(chóng)屬的一種。刺激隱核蟲(chóng)常寄生于海水硬骨魚(yú)類的皮膚、鰓的上皮下，可引起魚(yú)類的傳染性疾病。刺激隱核蟲(chóng)病是海水魚(yú)養(yǎng)殖中危害最大的寄生蟲(chóng)性疾病,又被漁民稱為海水魚(yú)白點(diǎn)病。目前,刺激隱核蟲(chóng)病尚不屬于國(guó)家規(guī)定的水生動(dòng)物疫病和人魚(yú)共患疾病,但因其傳染性較強(qiáng),可感染尖吻鱸、紫紅笛鯛、東方鲀、大黃魚(yú)、美國(guó)紅魚(yú)、鱸魚(yú)、金鯧、石斑魚(yú)、藍(lán)子魚(yú)、白胡椒鯛、真鯛、黑鯛、平鯛、紅鰭笛鯛等各個(gè)品種的海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖魚(yú)類,危害嚴(yán)重時(shí)甚至形成暴發(fā)性流行的水生動(dòng)物疫病,特別是魚(yú)苗,感染率和死亡率均可達(dá) 100%,造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，因此刺激隱核蟲(chóng)的快速檢測(cè)具有重要的意義。本產(chǎn)品就是以探針?lè)晒舛?PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)的專門檢測(cè)刺激隱核蟲(chóng)的通用試劑盒。
1. 即開(kāi)即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。
2. 引物和探針經(jīng)過(guò)優(yōu)化，靈敏性高。
3. 提供陽(yáng)性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。
4. 特異性高，引物是根據(jù)刺激隱核蟲(chóng)高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會(huì)跟其他病毒 DNA發(fā)生交叉反應(yīng)。
5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針?lè)晒舛?PCR 反應(yīng)。
規(guī)格及成分：
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編號(hào) |
成分 |
規(guī)格 |
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試劑一 |
2×Probe qPCR MagicMix |
500μL（本色蓋） |
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試劑三 |
熒光PCR專用模板稀釋液 |
1mL（黃蓋） |
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試劑二 |
刺激隱核蟲(chóng)探針?lè)?/span>qPCR引物混合液 |
100μL（白蓋） |
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試劑四 |
刺激隱核蟲(chóng)探針?lè)?/span>qPCR探針 |
50μL（棕色管） |
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試劑五 |
刺激隱核蟲(chóng)探針?lè)?/span>qPCR陽(yáng)性對(duì)照(1×10E8/μL) |
50μL（紅蓋） |
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使用手冊(cè) |
1份 |
低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為 12 個(gè)月。
自備試劑：
樣品DNA。
使用方法：
一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）：
由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照，只提供無(wú)傳染性的 DNA 片段作為陽(yáng)性對(duì)照。
1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。
3. 在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。
6. 放冰上待用。重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品DNA的制備：
7. 如果有 N 個(gè)樣品，最好設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽(yáng)性對(duì)照），一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對(duì)照）。可以用 10μL 陽(yáng)性對(duì)照的 10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為 NC。
8. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù) DNA 提取試劑盒兼容。
三、Probe qPCR反應(yīng)（20μL體系，在樣品制備室進(jìn)行）：
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），6個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個(gè) PCR管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），1 個(gè)用于 PCR 陽(yáng)性對(duì)照（用第 4 號(hào)管的陽(yáng)性對(duì)照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
10. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，并且陽(yáng)性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后最后加）：
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成份 |
N+2個(gè)樣品管 |
PCR陰性對(duì)照管 |
標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品管2-7管 |
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2×Probe qPCR MagicMix |
10μL |
10μL |
各10μL |
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刺激隱核蟲(chóng)探針?lè)?/span>qPCR探針 |
1μL |
1μL |
各1μL |
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刺激隱核蟲(chóng)探針?lè)?/span>qPCR引物混合液 |
2μL |
2μL |
各2μL |
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N+2個(gè)待測(cè)DNA模板 |
7μL |
-- |
-- |
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超純水 |
-- |
7μL |
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第7步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液2-7號(hào) |
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各7μL2號(hào)樣到2號(hào)管,3號(hào)樣到3號(hào)管 |
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過(guò)程 |
溫度 |
時(shí)間 |
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預(yù)變性 |
95℃ |
3 min |
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PCR反應(yīng)40個(gè)循環(huán) |
95℃ |
15 sec |
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60℃ |
1 min（采集FAM通道的熒光信號(hào)） |
12. 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 RNA濃度的 log 值，再推算出其濃度。
13. 如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽(yáng)性或陰性，則陰性對(duì)照 Ct 必須大于或等于 40。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對(duì)待測(cè)樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽(yáng)性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次。若重復(fù)結(jié)果 Ct值小于 40，擴(kuò)增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽(yáng)性，否則為陰性。
五、特別提示：
本公司的所有產(chǎn)品，僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！
