產品及特點:
1. 一站式,用于不需要單獨準備每種成分,包括引物和對照。
2. 根據蘋果銹果類病毒的保守基因序列設計的引物,具有良好的特異性。
3. 基于染料法qRT-PCR 檢測,靈敏度比常規 RT-PCR高10-100 倍,可以達到至少1000 拷貝/反應。
4. 使用一管式 qRT-PCR技術,RT和PCR 兩步在一個試管內完成,不需要中間轉移樣品,降低了操作誤差和可能的污染。
5. 本產品足夠50次30μL 體系的 RT-PCR,只能用于科研,不能用于臨床。
規格及成分:
編號 |
成分 |
規格 |
試劑一 |
2×qRT-PCR 緩沖液 |
500 μL(棕色管) |
試劑二 |
10×qRT-PCR 酶混合液 |
100 μL(紅蓋) |
試劑三 |
ROX 染料 I,50× |
20 μL(棕色管) |
試劑四 |
ROX 染料 II,50× |
20 μL(棕色管) |
試劑五 |
熒光 PCR 專用模板稀釋液 |
1mL(黃蓋) |
試劑六 |
蘋果銹果類病毒染料法 qRT-PCR 引物混合液 |
100 μL(白蓋) |
試劑七 |
蘋果銹果類病毒染料法 qRT-PCR 陽性對照 (1×10E8 /μL) |
50 μL(黃蓋) |
試劑八 |
沙核酸釋放劑(試用裝) |
20 次(1mL,綠蓋) |
試劑九 |
使用手冊 |
1 份 |
低溫運輸、-20℃保存,有效期一年。
陽性對照需要因易污染其他成分需要單獨放置。本產品不提供活體樣品做陽性對照,只提供 DNA 片段作為陽性對照。
自備試劑:
樣品 RNA。
使用方法:
一、稀釋陽性對照:
以 10E2-10E7 這 6 個 10 倍稀釋度為例,由于標準品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原。
1. 標記 6個離心管,分別為 7,6,5,4,3,2。用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光PCR專用模板稀釋液,最好用帶芯槍頭,下同)。
2. 在7號管中加入 5μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(本試劑盒提供),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
3. 換槍頭,在 6 號管中加入5μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩1分鐘,得1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
4. 換槍頭,在 5號管中加入5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩1分鐘,得1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。重復上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。
二、樣品 DNA 的制備:
5. 如果有 N 個樣品,必須設置 N+2 個提取,多出的一個是 PC(樣品制備陽性對照),一個是 NC(樣品制備陰性對照)。可以用 10μL 上步制備的陽性對照梯度稀釋液中的第 4 號(濃度為 1×10E4 拷貝/μL,10μL 相當于 1 萬拷貝)再加上一定量的水作為制備的陽性對照(加水后其總體積跟樣品一樣,樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求)。可以用水作為制備的陰性對照。
6. 用自選方法純化 N+2 個樣品的 RNA,本試劑盒跟市場上大多數病毒 RNA 提取試劑盒兼容。
三、設置RT-PCR 反應(20 μL 體系,在樣品制備室進行):
7. 如果做定量分析并且只做1次重復,則標記 N+9個PCR 管,其中 N+2 個用于上步得到的 N+2個樣品,1個用于PCR 陰性對照,6 個用于標準曲線。如果做定性分析,并且只做1次重復,則標記 N+4 個 PCR 管,其中 N+2 個用于上步得到的N+2個樣品,1個用于 PCR陰性對照(用水做模板),1 個用于 PCR陽性對照(用第 4號陽性對照稀釋液做模板)。下面只描述定量分析的步驟,定性分析只是把6個標曲反應縮減成 1個,其余不變。
8. 在標記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照,陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子后最后加):
成分 |
N+2個制備 所得樣品 |
qRT-PCR 陰性對照 |
qRT-PCR陽性對照(2-7管) |
2×qRT-PCR緩沖液 |
10μL |
10μL |
各10μL |
蘋果銹果類病毒染料法qRT-PCR引物混合物 |
2μL |
2μL |
各2μL |
50×ROX (見注) |
0.4μL |
0.4μL |
各0.4μL |
樣品制備所得RNA 模板(來于第8步) |
5.6μL |
-- |
-- |
稀釋所得6個陽性對照 (來于第6步) |
-- |
-- |
各5.6μL2號樣到2號 管,3號樣到3號管 |
超純水 |
-- |
5.6μL |
-- |
10×qRT-PCR酶混合液 |
2μL |
2μL |
2μL |
需使用 ROX 染料 II 的機型:ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research的 Chromo4、Opticon(II)Corbett Rotor Gene 3000。
不需要使用ROX 的機型:Thermal Cycle Dice Real Time System,LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene3000、RotorGene 6000。
9. 上機后按下面參數進行 RT-PCR(參數可能會因儀器不同而需優化)。
過程
溫度
時間
RT(逆轉錄)
50℃
15-30 min
預變性
95℃
5 min
Qrt-PCR反應40個循環
95℃
15 sec
58℃
1 min,(采集FAM通道的熒光信號)
按儀器預設程序進行溶解曲線分析
四、數據處理:
11. 如果把本試劑盒用于定性檢測,只判斷陽性或陰性,則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數增長,有典型擴增曲線,Ct 值應該小于或等于 30。對待測樣品,如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性,如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間,則重復一次。重復實驗的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性,如果小于 40,則為陽性。
五、特別提示:
本公司的所有產品,僅可用于科研實驗,嚴禁用于臨床醫療及其他非科研用途!