產(chǎn)品及特點:
寨卡病毒(Zika Virus,ZIKV)是一種 RNA 病毒,感染后典型的癥狀包括急性起病的低熱、斑丘疹、關(guān)節(jié)疼痛(主要累及手、足小關(guān)節(jié))、結(jié)膜炎,其他癥狀包括肌痛、頭痛、眼眶痛及無力。另外少見的癥狀包括腹痛、惡心、嘔吐、黏膜潰瘍和皮膚瘙癢。癥狀通常較溫和,持續(xù)不到一周,需要住院治療的嚴(yán)重病情并不常見,因此快速準(zhǔn)確鑒定對該病的預(yù)防和檢疫有著重要作用。本產(chǎn)品以探針法熒光定量 RT-PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測寨卡病毒的試劑盒,它具有下列特點:
1. 即開即用,用戶只需要提供樣品 RNA 模板。
2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化,靈敏性高。
3. 提供陽性對照,便于區(qū)分假陰性樣品。
4. 特異性高,引物是根據(jù)寨卡病毒高度保守區(qū)設(shè)計,不會跟其他病毒的RNA發(fā)生交叉反應(yīng)。
5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 RT-PCR 反應(yīng)。
6. 本產(chǎn)品只能用于科研。
規(guī)格及成分:
編號 |
成分 |
規(guī)格 |
試劑一 |
探針法 qRT-PCR 緩沖液 |
500 μL(藍(lán)蓋) |
試劑二 |
探針法 qRT-PCR 酶混合液 |
100 μL(紅蓋) |
試劑三 |
熒光 PCR 專用模板稀釋液 |
1 mL(黃蓋) |
試劑四 |
寨卡病毒探針法qRT-PCR引物混合液 |
100 μL(白蓋) |
試劑五 |
寨卡病毒 qRT-PCR 探針 |
50 μL(棕色管) |
試劑六 |
寨卡病毒探針法qRT-PCR陽性對照(1×10E8/μL) |
50 μL(黃蓋) |
使用手冊 |
1 份 |
低溫運輸、-20℃保存,有效期一年。
自備試劑:
樣品 RNA。
使用方法:
一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品(以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例):
由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進(jìn)行,千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原,本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照,只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。
1. 標(biāo)記 6 個離心管,分別為 7,6,5,4,3,2。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 RT-PCR 專用模板稀釋液,最好用帶芯槍頭,下同)。
3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭,在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭,在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品 RNA 的制備:
7. 如果有 N 個樣品,最好設(shè)置 N+2 個提取,多出的一個是 PC(樣品制備陽性對照),一個是 NC(樣品制備陰性對照)。可以用 10μL 陽性對照的 10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,以此作為PC。另外用水作為 NC。
8. 用自選方法純化樣品的 RNA,本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒 RNA 提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的柱式病毒 RNAout。
三、Probe qRT-PCR 反應(yīng)(20μL 體系,在樣品制備室進(jìn)行):
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù),則標(biāo)記 N+9 個 PCR 管,其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品,1 個用于 PCR 陰性對照(用水做模板),6個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析,并且只做 1 次重復(fù),則標(biāo)記 N+4 個 PCR管,其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品,1 個用于 PCR 陰性對照(用水做模板),1 個用于 PCR 陽性對照(用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板)。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
10. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照,并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加):
成份 |
樣品管N+2個 |
RT-PCR陰性對照管 |
標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品管2-7管 |
探針法 qRT-PCR 緩沖液 |
各 10 μL |
10 μL |
各 10 μL |
探針法 qRT-PCR 酶混合液 |
各 2 μL |
2 μL |
各 2 μL |
寨卡病毒qRT-PCR 探針 |
各 1 μL |
1 μL |
各 1 μL |
寨卡病毒探針qRT-PCR引物混合液 |
各 2 μL |
2 μL |
各 2 μL |
待測樣品 RNA 模板 |
各 5 μL |
-- |
-- |
超純水 |
-- |
5 μL |
-- |
第7步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液2-7號 |
不加 |
不加 |
各5 μL (2號樣到2號管,3號樣到3號管) |
過程 |
溫度 |
時間 |
逆轉(zhuǎn)錄 |
50℃ |
30 min |
預(yù)變性 |
94℃ |
10 min |
qRT-PCR反應(yīng)35個循環(huán) |
94℃ |
15 sec |
60℃ |
1 min,(采集FAM通道的熒光信號) |
12. 如果把本試劑盒用于定量檢測,則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸,以 Ct值為縱軸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品RNA 濃度的 log 值,再推算出其濃度。
13. 如果把本試劑盒用于定性檢測,只判斷陽性或陰性,則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長,有典型擴(kuò)增曲線,Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對待測樣品,如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性,如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間,則重復(fù)一次。重復(fù)實驗的 Ct值如果大于或等于 40 則為陰性,如果小于 40,則為陽性。
五、特別提示:
本公司的所有產(chǎn)品,僅可用于科研實驗,嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途!