豬呼腸孤病毒探針法熒光定量RT-PCR試劑盒
產品及特點：
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 RNA 模板。
2. 引物和探針經過優化，靈敏性高。
3. 提供陽性對照，便于區分假陰性樣品。
4. 特異性高，引物是根據豬呼腸孤病毒高度保守區設計，不會跟其他病毒的RNA發生交叉反應。
5. 本產品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 RT-PCR 反應。
6. 本產品只能用于科研。
規格及成分：
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編號
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成分
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規格
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試劑一
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探針法 qRT-PCR 緩沖液
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500 μL（藍蓋）
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試劑二
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探針法 qRT-PCR 酶混合液
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100 μL（紅蓋）
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試劑三
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熒光 PCR 專用模板稀釋液
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1 mL（黃蓋）
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試劑四
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豬呼腸孤病毒探針法qRT-PCR引物混合液
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100 μL（白蓋）
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試劑五
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豬呼腸孤病毒 qRT-PCR 探針
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50 μL（棕色管）
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試劑六
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豬呼腸孤病毒探針法qRT-PCR陽性對照(1×10E8 /μL)
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50 μL（黃蓋）
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使用手冊
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1 份
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運輸及保存：
低溫運輸、-20℃保存，有效期一年。
自備試劑：
樣品 RNA。
使用方法：
一、稀釋標準曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）：
由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。
1. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 RT-PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。
3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品 RNA 的制備：
7. 如果有 N 個樣品，最好設置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）。可以用 10μL 陽性對照的 10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為 NC。
8. 用自選方法純化樣品的 RNA，本試劑盒跟市場上大多數病毒 RNA 提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的柱式病毒 RNAout。
三、Probe qRT-PCR 反應（20μL 體系，在樣品制備室進行）：
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個 PCR管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
10. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：
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成份
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樣品管N+2個
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RT-PCR陰性對照管
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標準曲線樣品管2-7管
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探針法 qRT-PCR 緩沖液
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各 10 μL
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10 μL
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各 10 μL
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探針法 qRT-PCR 酶混合液
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各 2 μL
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2 μL
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各 2 μL
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豬呼腸孤病毒 qRT-PCR 探針
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各 1 μL
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1 μL
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各 1 μL
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豬呼腸孤病毒探針qRT-PCR引物混合液
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各 2 μL
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2 μL
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各 2 μL
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待測樣品 RNA 模板
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各 5 μL
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--
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--
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超純水
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--
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5 μL
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--
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第7步所得標準曲線樣品稀釋液2-7號
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不加
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不加
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各5 μL (2號樣到2號管，3號樣到3號管)
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11. 蓋上蓋子后上機，按下面參數進行 qRT-PCR：
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過程
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溫度
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時間
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逆轉錄
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50℃
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30 min
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預變性
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94℃
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10 min
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qRT-PCR反應35個循環
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94℃
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15 sec
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60℃
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1 min，(采集FAM通道的熒光信號)
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四、數據處理：
12. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品RNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。
13. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復一次。重復實驗的 Ct值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽性。
五、特別提示：
本公司的所有產品，僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫療及其他非科研用途！
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