ELISA（酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)）是一種快速、靈敏、準(zhǔn)確可靠的一種定量分析方法，樣本收集、處理及保存對(duì)ELISA實(shí)驗(yàn)起著關(guān)鍵作用。利用ELISA進(jìn)行檢測(cè)的樣本類型包括血液（血清、血漿），組織勻漿、細(xì)胞裂解液、細(xì)胞培養(yǎng)上清等。這些樣本收集的時(shí)間、處理方法和保存都會(huì)影響到ELISA實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。下面是通蔚生物為大家詳細(xì)介紹常見的樣本收集、處理和保存方法。
目錄：
1、ELISA樣本制備技巧
2、ELISA常見樣本收集、處理
3、ELISA樣本保存
ELISA樣本制備技巧
1.采集血液樣本時(shí)應(yīng)盡量避免發(fā)生溶血。
2.采集抗凝全血后，應(yīng)輕輕倒置管子，確保充分抗凝，防止部分血液未與抗凝劑接觸而引起凝血。
3.收集組織和細(xì)胞提取物樣本時(shí)，不建議使用市售裂解緩沖液。裂解緩沖液中的表面活性劑可能會(huì)影響分析物的天然構(gòu)象，從而可能導(dǎo)致測(cè)量值顯著降低或出現(xiàn)假陰性。此外，由于引入了新溶劑，潛在的基質(zhì)干擾不確定，這可能會(huì)增加背景水平并影響測(cè)量準(zhǔn)確性。
4.避免使用高脂血癥樣本。高脂樣本含有脂質(zhì)，且并非均質(zhì)溶液，若直接上樣，可能會(huì)干擾抗原抗體結(jié)合，從而影響測(cè)定準(zhǔn)確性。
5.如果樣品需要在一周內(nèi)檢測(cè)，請(qǐng)將其保存在2-8°C下。如果不能及時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，請(qǐng)根據(jù)使用量分裝樣品，并將其保存在-20°C或-80°C下，以避免反復(fù)凍融循環(huán)。血清、血漿、細(xì)胞和組織提取物通常用結(jié)合緩沖液稀釋50%。
6.勻漿中總蛋白濃度至少應(yīng)為1mg/mL，最好為2mg/mL以上。
7.采集的樣本可保存不同期限：48小時(shí)（2-8℃），1個(gè)月（-20℃）或6個(gè)月（-70℃）。
8.裂解物的蛋白質(zhì)濃度可以通過不受洗滌劑抑制的總蛋白質(zhì)測(cè)定法（如二辛可寧酸(BCA)測(cè)定法）來確定。每個(gè)樣品的體積也可以標(biāo)準(zhǔn)化，以便每次測(cè)定提供相同量的總蛋白質(zhì)。
ELISA常見樣本收集、處理
血清
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將全血收集到不含添加劑的試管中。
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將血液在室溫下保存30分鐘。
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以3,000rpm和4°C離心10分鐘。
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立即測(cè)定或分裝上清液（血清）并保存在-80°C（避免凍融循環(huán)）。
注意：采集血清樣本時(shí)應(yīng)避免溶血。發(fā)生溶血的樣本可能會(huì)增加HRP偶聯(lián)ELISA檢測(cè)中的非特異性染色。此外，還要避免細(xì)菌污染，因?yàn)榧?xì)菌體中含有內(nèi)源性HRP，也會(huì)產(chǎn)生假陽性。血清標(biāo)本易在新鮮時(shí)檢測(cè)，如在冰箱中保存過久，其中可發(fā)生聚合，在間接法ELISA中可使本底加深。
血漿
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用含抗凝劑的采血管或離心管采集血液標(biāo)本。
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30分鐘內(nèi)于冰上分離血漿以減少血小板的污染。
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將采集血液用離心機(jī)4℃，2500rpm離心5min，將離心好的勻漿留上清，棄下面沉淀。
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取上清，分裝凍存儲(chǔ)備
注意事項(xiàng)：制備血漿標(biāo)本要借助抗凝劑EDTA，抗凝不完全的標(biāo)本因纖維蛋白原干擾而造成假陽性。
組織勻漿
用PBS沖洗組織以去除多余的血液。
將組織在冰冷緩沖液中切成1-2毫米的碎片，放在冰上立即均質(zhì)化或在-80°C下保存以供稍后使用。
準(zhǔn)備提取緩沖液。可以提前配制并儲(chǔ)存在4°C下。
1)、100mMTris，pH7.4
2)、150毫米氯化鈉
3）、1毫米EGTA
4）、1毫米EDTA
5）、1%TritonX-100
6）、0.5%脫氧膽酸鈉
使用前，必須立即向提取緩沖液中添加以下物質(zhì)，以生成完整的提取緩沖液。
1）、磷酸酶抑制劑混合物
2）、蛋白酶抑制劑混合物
3）、PMSF（苯甲基磺酰氟）至1mM
對(duì)于每0.1毫克組織，向管中添加500μL完全提取緩沖液并均質(zhì)化。
用500μL提取緩沖液沖洗均質(zhì)機(jī)刀片2次。
將樣品放在4°C的振蕩器上搖動(dòng)1小時(shí)。
將樣品以約10000Xg的速度離心5分鐘。
立即測(cè)定或分裝上清液（可溶性蛋白質(zhì)提取物）并保持在-80°C（避免凍融循環(huán)）。
細(xì)胞裂解物
收集細(xì)胞并用PBS沖洗。
在裂解緩沖液（例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞蛋白提取試劑，Boster目錄編號(hào)：AR0103）中徹底均質(zhì)化并裂解細(xì)胞。
將細(xì)胞裂解物在約10,000xg和4°C下離心5分鐘。
立即測(cè)定或分裝上清液并保存在-80°C（避免凍融循環(huán)）。
細(xì)胞培養(yǎng)上清液
將細(xì)胞培養(yǎng)基以1,500rpm和4°C的速度離心10分鐘。
立即測(cè)定或分裝上清液并保存在-80°C（避免凍融循環(huán)）。
等離子體
將全血收集到含有抗凝劑的試管中（不同的蛋白質(zhì)可能需要不同的抗凝劑，有關(guān)抗凝劑用途的詳細(xì)信息，請(qǐng)參閱數(shù)據(jù)表）。
以3,000rpm和4°C離心10分鐘。
立即測(cè)定或分裝上清液（血漿）并保存在-80°C（避免凍融循環(huán)）。
尿
將尿液收集到無菌或一次性容器中（新鮮尿液樣本必須立即使用或保存，以避免產(chǎn)生內(nèi)源性HRP的細(xì)菌繁殖，從而產(chǎn)生潛在的假陽性結(jié)果）。
將樣品以10,000xg的速度離心1分鐘。
立即測(cè)定或分裝上清液并保存在-80°C下。（避免反復(fù)凍融）。
唾液
使用不具備任何蛋白質(zhì)結(jié)合或過濾功能的收集裝置（例如Salivette）收集唾液。
以10,000xg和4°C離心2分鐘。
立即測(cè)定或分裝上清液并保存在-80°C（避免凍融循環(huán)）。
牛奶
在1500xg和4°C下離心15分鐘。
收集水性部分并重復(fù)此過程3次。
通過0.2μm過濾器過濾。
立即測(cè)定或分裝上清液并保存在-80°C（避免凍融循環(huán)）。
ELISA樣本保存
①樣本收集后如在一周內(nèi)檢測(cè)，可置于4℃保存；
②若不能及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)按一次使用量進(jìn)行小份分裝，置于-20℃（1個(gè)月內(nèi)檢測(cè)）或-80℃（半年內(nèi)檢測(cè)）保存，避免反復(fù)凍融。
③還應(yīng)保證樣本不含NaN3，因?yàn)镹aN3會(huì)抑制HRP的活性，從而導(dǎo)致假陰性結(jié)果出現(xiàn)。
導(dǎo)致樣本溶血的原因及如何避免
在樣本處理中，溶血是指紅細(xì)胞破裂，釋放血紅蛋白到血清或血漿中。溶血可由各種物理、化學(xué)和毒性因素引起。體外，機(jī)械攪拌或低溫冷凍可導(dǎo)致溶血。
發(fā)生溶血后，內(nèi)源性HRP酶和血紅蛋白的過氧化物酶樣活性會(huì)導(dǎo)致ELISA中不受控制的非特異性染色，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。如果樣本發(fā)生輕微溶血，建議在與標(biāo)準(zhǔn)品孵育后洗板1-3次，以盡量減少干擾。如果發(fā)生嚴(yán)重溶血，建議收集新的樣本。
為避免溶血影響檢測(cè)結(jié)果，請(qǐng)確保靜脈穿刺壓力不要過高，避免采血量過少，采血時(shí)動(dòng)作輕柔，避免劇烈搖晃，離心速度不要過高，采得的全血應(yīng)及時(shí)處理成血清/血漿，避免全血凍融。如果采血時(shí)需要麻醉，請(qǐng)使用不會(huì)引起溶血的麻醉劑。
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