ELISA實(shí)驗(yàn)弱陽性，背景高......罪魁禍?zhǔn)卓赡苁恰皻馀荨?/h1>

發(fā)布時(shí)間：2024-10-24     發(fā)布作者：上海通蔚生物

  在進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)，酶標(biāo)板孔內(nèi)氣泡導(dǎo)致孔內(nèi)的溶液不能與孔壁接觸，使孔內(nèi)反應(yīng)不一。那么，氣泡對(duì)ELISA實(shí)驗(yàn)會(huì)產(chǎn)生什么樣的影響呢？下文上海通蔚生物為您詳細(xì)介紹因素及對(duì)應(yīng)的辦法。

  目錄

  1、認(rèn)識(shí)ELISA原理

  2、氣泡干擾因素及辦法補(bǔ)救

  ELISA原理

  在進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)，通常會(huì)在酶標(biāo)板包被抗原/抗體使其發(fā)生特異性反應(yīng)，然后通過酶標(biāo)抗體和底物顯色。在實(shí)驗(yàn)過程，還要對(duì)其進(jìn)行封閉，通過封閉減少外源物質(zhì)特異性結(jié)合。如果孔內(nèi)一旦有氣泡，會(huì)導(dǎo)致抗原/抗體結(jié)合受到影響，從而影響實(shí)驗(yàn)的可靠性；其次封閉不充分，容易產(chǎn)生假陽性等問題。

  氣泡干擾因素

  了解氣泡干擾因素對(duì)實(shí)驗(yàn)是非常重要的步驟，所謂“知己知彼百戰(zhàn)百勝”。通常氣泡干擾因素如下：

  1、干擾抗原/抗體結(jié)合

  抗原/抗體結(jié)合是ELISA實(shí)驗(yàn)比較關(guān)鍵環(huán)節(jié)，只要結(jié)合在一起，我們才能有效檢測(cè)出樣本中的有效成分。在加樣時(shí)產(chǎn)生氣泡可能會(huì)導(dǎo)致抗原、抗體溶液不能均勻的分布在酶標(biāo)板孔內(nèi)，從而影響抗原和抗體的有效結(jié)合。從而導(dǎo)致檢測(cè)信號(hào)減弱或者出現(xiàn)假陽性或弱陽性結(jié)果。

  2、影響孔內(nèi)反應(yīng)均勻性

  酶標(biāo)板的主要成分是聚苯乙烯，具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后保留原來的免疫活性。如果孔內(nèi)產(chǎn)生氣泡，氣泡影響了溶液的整體均勻性，從而影響抗原抗體間的有效混合和反應(yīng)，導(dǎo)致孔內(nèi)反應(yīng)不均一，影響最終的顯色反應(yīng)，可能使吸光度值不準(zhǔn)確，增加實(shí)驗(yàn)的變異性。

  3、包被和封閉問題

  對(duì)于部分ELISA類型實(shí)驗(yàn)，如間接ELISA/夾心ELISA法通常會(huì)采用包被和封閉。包被使抗體/抗原固定在酶標(biāo)板，為下一步封閉做準(zhǔn)備。而氣泡會(huì)導(dǎo)致包被抗體和封閉蛋白不均勻，減少實(shí)際包被量，造成弱陽性。同時(shí)，氣泡會(huì)造成未結(jié)合的位點(diǎn)增多，從而增加背景信號(hào)，造成非特異性結(jié)合，提高本底，從而可能產(chǎn)生假陽性結(jié)果。

  4、讀數(shù)偏差

  ELISA實(shí)驗(yàn)最后一步往往會(huì)需要進(jìn)行讀數(shù)，氣泡在孔中或在酶標(biāo)板表面可能會(huì)在讀取吸光度時(shí)造成光路的異常散射或遮擋，影響讀數(shù)的準(zhǔn)確性，尤其是在使用酶標(biāo)儀進(jìn)行光吸收測(cè)量時(shí)，可能會(huì)得到錯(cuò)誤的吸光度值。

  上述通蔚生物為大家總結(jié)ELISA實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生的氣泡對(duì)ELISA實(shí)驗(yàn)造成的影響，那么如何補(bǔ)救呢？

  首先，我們要知道氣泡產(chǎn)生的原因，我這里給大家總結(jié)比較常見的原因：

  1、操作不當(dāng)。在適應(yīng)微量移液器進(jìn)行加樣時(shí)，有時(shí)候速度過快和過猛都會(huì)導(dǎo)致氣泡產(chǎn)生。加樣時(shí)盡量靠近孔底，用力均勻，不要用力過猛。

  2、實(shí)驗(yàn)器材問題。微量移液器精度不足或者槍頭質(zhì)量不佳，可能導(dǎo)致液體在轉(zhuǎn)移過程中產(chǎn)生氣泡，同時(shí)不合適的槍頭密封性差也會(huì)引入氣泡。微量移液器定期進(jìn)行校驗(yàn)和維護(hù)，確保每次轉(zhuǎn)移的體積精確，減少氣泡生成的機(jī)會(huì)。

  3、洗滌過程。洗滌時(shí)一定要加滿孔，氣泡會(huì)浮上來最終被驅(qū)除。手動(dòng)洗板一定要吸干水分并用力拍干。

  通過上述介紹，氣泡對(duì)ELISA實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的影響是很大的，因此，科研人員嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行，避免氣泡產(chǎn)生，影響到最終實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。